Utilizzare un candelabro uovo per tracciare lungo il perimetro della sacca d'aria sopra l'embrione E14 o E15 con una matita e coprire l'area delineata con nastro trasparente. Usando forbici curve o fini, tagliare delicatamente intorno all'area tracciata. Fare attenzione a non tagliare la membrana embrionale o i vasi sanguigni.
Quindi scartare il pezzo superiore del guscio. Dopo aver decapitato l'embrione di pulcino, posizionare la testa in un piatto di 10 centimetri con una soluzione fredda e sterile di CMF. Usando una pinza fine sterile, staccare la pelle che copre il cervello per rivelare la dura madre sottostante.
Rimuovere le ossa del cranio in formazione sui lati sinistro e destro del cervello. Le ossa del cranio in formazione non coprono ancora la maggior parte del cervello. Usa delicatamente una pinza appuntita fine per strappare le meningi, sovrastando il centro del cervello e sbucciarlo su ciascun lato per scoprire il cervello.
Usando una pinza curva fine, raccogli il cervello dalla parte anteriore inferiore e tiralo delicatamente fuori dalla sua cavità. Seziona il cervello nelle sue tre parti principali proencefalo, mesencefalo o tecta ottica e cervelletto. Rimuovere la pia madre sovrastante dalla tecta usando una pinza fine e posizionare le regioni cerebrali sezionate in un piccolo piatto sterile sul ghiaccio.
Per incorporare e affettare il cervello, raccogliere delicatamente il tectum ottico o la regione del proencefalo con una pinza curva come paletta e asciugare leggermente su una garza sterile per rimuovere il liquido in eccesso. Preparare uno stampo semplice formando un foglio di alluminio attorno a un oggetto di dimensioni appropriate. Qui, un piccolo blocco rettangolare di affettatrice di tessuto vibrante in metallo viene utilizzato come oggetto.
Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile e riempire lo stampo con agarosio a basso punto di fusione. Posizionare rapidamente la regione del cervello in agarosio e lasciarla solidificare per circa quattro o cinque minuti sul ghiaccio. Tagliare le sezioni su un'affettatrice vibrante usando un coltello di zaffiro.
Utilizzare la spatola sterile per raccogliere e rimuovere la fetta dal vassoio. Far scorrere delicatamente la sezione dalla spatola e su un inserto di membrana usando un'altra spatola sterile. Posizionare la piastra a sei pozzetti di fette di cervello su inserti di membrana nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Il giorno dopo la placcatura, utilizzare una pipetta sterile Pasteur per aspirare il mezzo da sotto l'inserto e aggiungere un millilitro di mezzo fresco a ciascuna pozzetta sotto l'inserto della membrana. Successivamente, per introdurre le cellule GBM sulle fette di cervello, rimuovere da uno a diversi sferoidi dal loro piatto di coltura utilizzando una micro pipetta da 20 micro litri impostata su cinque microlitri. Espellere delicatamente il terreno con sferoidi sulla fetta di cervello desiderata e lasciare che gli sferoidi si riproducano sulla fetta per due o cinque giorni.
I risultati di vitalità delle fette di tectum ottico x vivo dopo una settimana in coltura sono mostrati in questa figura. Le immagini confocali di una fetta di cervello colorata per nuclei con bisbenzimmide e immunocolorata per laminina mostrano chiaramente vasi sanguigni normali e intatti sezionati otticamente in varie configurazioni. L'immagine di massima proiezione dello stack Z confocale della fetta di cervello colorata per il fattore di trascrizione SOX 2 e nuclei totali con bisbenzimmide è mostrata qui.
Questi risultati suggeriscono che le fette di cervello dell'embrione di pulcino potrebbero essere coltivate su inserti di membrana per circa due settimane e rimanere vitali con vasi sanguigni e espressione del fattore di trascrizione che appaiono normali.
