Per infettare i cotiledoni di soia con Agrobacterium rhizogenes, progettare primer per rilevare il gene plasmidico TI virD2 utilizzando la sequenza del plasmide Agrobacterium rhizogenes PRI2659 plasmide. Dopo la trasformazione, testare le colonie di Agrobacterium per la ritenzione di virD2 mediante PCR utilizzando un kit PCR. Dopo aver selezionato le colonie di Agrobacterium rhizogenes contenenti sia virD2 che il gene di interesse, striare alcune colonie sulle piastre LB contenenti 100 milligrammi per litro di spectinomicina per il plasmide di interesse.
Il giorno seguente, utilizzando una punta per pipetta P200, raschiare via una lunghezza di 1,5 centimetri dell'Agrobacterium dalla piastra LB e risospenderla in un millilitro di tampone fosfato. Diluire la sospensione cellulare risospesa e sterilizzare l'acqua ultrapura in acetosiringone. Misurare l'assorbanza utilizzando un tubo cuvetta a una densità ottica di 600 nanometri.
Successivamente, in un armadio di biosicurezza, immergere un bisturi sterilizzato nella soluzione di Agrobacterium e fare un taglio profondo un millimetro lungo la superficie interna del cotiledone. Posizionare da sei a otto cotiledoni tagliati con il lato rivolto verso il basso su una piastra di Petri contenente carta da filtro satura di germinazione e terreno di coltura con acetosiringone. Incubare le lastre a temperatura ambiente per tre giorni in un periodo di foto di 16 ore.
Dopo tre giorni, trasferire i cotiledoni infetti alla crescita delle radici pelose o alle piastre HRG. Incubare le piastre nelle camere di crescita impostate a 22 gradi Celsius e un'intensità luminosa di 100 micromoli su un periodo di foto di 16 ore fino a quando non si osservano radici primarie con radici secondarie lunghe da due a tre centimetri. Dopo tre o quattro settimane, raccogli le radici primarie che crescono dal callo e contengono radici secondarie usando un bisturi sterile e una pinza.
Trasferire le radici in piastre HRG di selezione contenenti antibiotici appropriati e lasciarle crescere per altri cinque giorni. Il quinto giorno, raccogli radici pelose transgeniche con radici secondarie lunghe da tre a sei centimetri. Se si osservano proteine fluorescenti, assicurarsi che le radici secondarie abbiano poca autofluorescenza.
Successivamente, per eseguire trattamenti elicitori o chimici, tagliare le radici secondarie in pezzi di un centimetro e posizionare circa 100 milligrammi su agar HRG in una pila. Quindi saturare la pila con 80 microlitri della soluzione di trattamento appropriata e lasciare che la piastra incubi a temperatura ambiente. Dopo 24 ore, per l'estrazione dell'RNA, tamponare rapidamente le radici essiccate su un tovagliolo di carta sterilizzato e raccoglierle direttamente in un tubo di microcentrifuga da due millilitri.
Sigillare immediatamente la parte superiore del tubo usando il parafilm e praticare due piccoli fori con una pinza appuntita. Vengono mostrati i risultati della PCR di colonia dell'Agrobacterium trasformato. Le colonie positive nella PCR hanno indicato il gene di interesse.
Tuttavia, da un terzo a metà delle colonie erano negative per lo screening del gene virD2. La microscopia a fluorescenza dimostra la localizzazione subcellulare di GFP-GmJAZ1-6. L'analisi dell'espressione genica ha confermato la sovraespressione del fattore di trascrizione della gliceollina GmHSF6-1 e il silenziamento dell'RNAi di GmMYB2912 nelle radici di Williams 82.
