Per iniziare, seminare le cellule HEK293A su vetrini di copertura lucidi posti in una piastra da 24 pozzetti contenente DMEM ad alto contenuto di glucosio fino a quando non diventano confluenti all'80%. Il giorno dopo, le cellule sono state affamate per due ore nella soluzione salina bilanciata di Earl. Dopo il trattamento, aspirare il terreno e aggiungere 500 microlitri o una soluzione di formaldeide al 4% in PBS e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule.
Dopo il fissaggio, sostituire la soluzione di formaldeide con 500 microlitri di PBS. Successivamente, spegnere il gruppo aldeidico libero aggiungendo 500 microlitri di soluzione di cloruro di ammonio 50 millimolari in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Sostituire la soluzione di cloruro di ammonio con 500 microlitri di una soluzione di digitonina da 50 microgrammi per millilitro in PBS per cinque minuti per permeabilizzare le cellule.
Dopo la permeabilizzazione, sostituire la soluzione di digitonina con 500 microlitri di PBS ripetendo il lavaggio PBS tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare le cellule in 500 microlitri di soluzione bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, sostituire la soluzione bloccante con 500 microlitri di PBS.
Successivamente, utilizzando una pinzetta, raccogliere i vetrini coprioggetto dal pozzetto e rimuovere il PBS in eccesso utilizzando salviette in tessuto sottile. Nella camera umidificata, adagiare delicatamente il vetrino coprioggetto con il lato cellulare rivolto verso il basso su una goccia di 50 microlitri di soluzione anticorpale primaria. Incubare le cellule in una camera umidificata per un'ora a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, raccogliere i vetrini coprioggetto e drenare la soluzione anticorpale primaria in eccesso. Riposizionare i foglietti di copertura nella piastra a 24 pozzetti con il lato cellulare rivolto verso l'alto e lavarli tre volte con PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, raccogliere i vetrini coprioggetto e scolare il PBS in eccesso prima di posizionare ciascun vetrino coprioggetto con il lato cellulare rivolto verso il basso su una goccia da 50 microlitri di soluzione anticorpale secondaria.
Incubare in una camera umidificata per un'ora. Dopo l'incubazione, scolare la soluzione anticorpale secondaria in eccesso e lavare il vetrino coprioggetto tre volte con 500 microlitri di PBS nella piastra a 24 pozzetti. Dopo aver drenato il PBS in eccesso, posizionare ogni vetrino coprioggetto con il lato cellulare rivolto verso il basso su una goccia di 50 microlitri di soluzione di ganci diluita da uno a 4.000 in PBS in una camera umidificata.
Incubare in una camera umidificata per cinque minuti. Successivamente, rimuovere la soluzione di ganci in eccesso e lavare i vetrini di copertura tre volte con PBS e una volta con acqua deionizzata in una piastra a 24 pozzetti. Dopo aver drenato l'acqua deionizzata in eccesso, posizionare ciascun vetrino coprioggetto su una goccia da 10 a 20 microlitri di soluzione di montaggio individuata su un vetrino da microscopio evitando la formazione di bolle d'aria.
