Per iniziare, inoculare Limosilactobacillus reuteri DSM20016 dal brodo di glicerolo in sei millilitri di brodo De Man, Rogosa, Sharpe o MRS, in un tubo da 50 millilitri. Incubare la coltura aerobicamente durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore statico. Il giorno successivo, inoculare quattro millilitri della coltura durante la notte in 200 millilitri di brodo MRS.
Lasciare che la coltura cresca aerobicamente in un incubatore statico a 37 gradi Celsius fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,5-0,85. Quindi, decantare la coltura in provette da centrifuga da 50 millilitri e posizionarle sul ghiaccio mentre si bilanciano i tubi. Centrifugare la coltura in una centrifuga pre-refrigerata e scartare il surnatante.
Prima di risospendere il pellet in 50 millilitri di acqua bidistillata prerefrigerata, ripetere la centrifugazione due volte. Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere il pellet in 25 millilitri di acqua bidistillata, saccarosio molare 0,5 e glicerolo al 10%. Centrifugare la sospensione cellulare, scartare il surnatante e risospendere il pellet in due millilitri di acqua doppia distillata, 0,5 molare di saccarosio e 10% di glicerolo su ghiaccio.
Aliquotare la sospensione in porzioni da 50 a 100 microlitri in provette da microcentrifuga prerefrigerate e conservare le provette a meno 80 gradi Celsius per un uso successivo. Quindi, per l'elettroporazione, scongelare un'aliquota di cellule elettrocompetenti sul ghiaccio. Mescolare da cinque a 10 microlitri di plasmide nell'aliquota scongelata evitando il più possibile il pipettaggio.
Trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione da un millilitro raffreddata a ghiaccio ed elettroporato a 1,25 kilovolt, 400 ohm e 25 microfarad. Dopo l'elettroporazione, aggiungere un millilitro di brodo MRS e mescolare capovolgendo la cuvetta una o due volte. Posizionare le cuvette in un'incubatrice statica a 37 gradi Celsius per 2,5-tre ore per il recupero.
Quindi, placcare l'intera sospensione su più piastre a coclea MRS con la selezione appropriata. Posizionare le piastre all'interno di un contenitore ermetico con una piccola candela accesa in una bustina generatrice di atmosfera anaerobica. Crescere a 37 gradi Celsius per due o tre giorni o fino a quando compaiono colonie visibili.
L'elettroporazione di L.reuteri con plasmide costitutivo mCherry2 che produce pTRKH3 dà efficienze di trasformazione di circa cinque-otto colonie per 200 microlitri placcati indipendentemente dalla condizione di metilazione del plasmide. La trasformazione con pNZ123 che non trasporta alcuna proteina reporter costitutiva esogena ha prodotto efficienze di trasformazione tre volte 10 ai quattro CFU per microgrammo di DNA.
