Iniziare pipettando una goccia di soluzione bloccante pronta all'uso con siero d'asina sui campioni di tessuto. Quindi incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione bloccante in eccesso dai vetrini picchiettando il bordo contro una superficie dura.
Diluire gli anticorpi primari nel tampone di diluizione degli anticorpi per preparare 100 microlitri della soluzione finale per ciascun campione. Impostare gli anticorpi, una provetta per ogni anticorpo primario e una per ogni anticorpo isocontrollo. Distribuire uniformemente 100 microlitri di anticorpi isocontrol su un campione e 100 microlitri di mieloperossidasi e istone citrullinato H3, o diluizione dell'anticorpo della mieloperossidasi e dell'elastasi neutrofila sull'altro campione.
Mettere i vetrini in una camera umida e conservarli per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, prelevare la soluzione anticorpale primaria in eccesso dai vetrini e impilarli in una cuvetta. Sciacquare i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno utilizzando soluzione salina tamponata Tris con interpolazione Per rimuovere la soluzione anticorpale primaria rimanente.
Preparare due anticorpi secondari nettamente fluorescenti, l'anti-capra dell'asino per la mieloperossidasi e l'anti-coniglio dell'asino per la colorazione dell'istone H3 citrullinato. Diluire ciascun anticorpo a 7,5 microgrammi per millilitro di concentrazione nel tampone di diluizione dell'anticorpo. Posizionare i vetrini in una camera umida ed erogare 100 microlitri della soluzione anticorpale secondaria su ciascun campione.
Incubateli per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria in eccesso picchiettando i vetrini. Metti i vetrini in una rastrelliera.
Immergere i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno in un barattolo colorante riempito di PBS per lavare via gli anticorpi non legati. Preparare la soluzione dappy e diluirla ad una concentrazione di un microgrammo per millilitro con acqua deionizzata. Immergere il rack per vetrini in un barattolo contenente la soluzione colorante e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente al buio.
Quindi, immergere la griglia per vetrini in un barattolo colorante con PBS per cinque minuti per lavare via la soluzione dappy in eccesso. Infine, montare i campioni utilizzando vetrini coprioggetti e mezzo di montaggio. L'anticorpo dell'istone citrullinato H3 si è legato solo agli istoni extracellulari e non ha mostrato alcuna colorazione degli istoni intracellulari.
L'anticorpo mieloperossidasi specifico per l'uomo o il topo non ha mostrato alcuna colorazione specifica. Mentre gli anticorpi universali umani e murini hanno mostrato una buona colorazione coerente per la mieloperossidasi. Quando non è stato utilizzato alcun agente bloccante, alcuni campioni di topo hanno mostrato una colorazione più aspecifica e parzialmente positiva.
Quando è stato bloccato, il tempo di blocco di cinque minuti ha mostrato buoni risultati rispetto al tempo di blocco di 10 minuti. Le temperature più elevate nel microonde e nel bagno d'acqua hanno mostrato un recupero dell'antigene da moderato a buono. Mentre in un bagno d'acqua a 60 gradi Celsius c'era solo parzialmente o nessuna colorazione.
Per la doppia colorazione, sono stati ottenuti risultati più favorevoli per i campioni incubati a bagnomaria a 96 gradi Celsius. Tuttavia, il superamento del tempo di incubazione di 40 minuti a 96 gradi Celsius ha comportato una colorazione anticorpale meno intensa.
