Per preparare il campione per la coltura di perfusione utilizzando il bioreattore stampato in 3D. In una cabina a flusso laminare, posizionare i campioni isolati di arteria carotide suina in mezzi di trasporto freddi. Usando una lama di bisturi, rimuovere il tessuto connettivo in eccesso e tagliare le estremità del tessuto.
Quindi lavare il tessuto due volte in mezzi di trasporto freddi. Successivamente, posizionare il tessuto nei mezzi di trasporto su un agitatore orbitale per un minimo di 30 minuti per un accurato lavaggio finale. Successivamente, collegare un segmento non ramificato dell'arteria lavata al sistema di bioreattore fabbricato utilizzando due connessioni per esche spinate.
E fissarlo utilizzando un legame vascolare fatto di fascette in silicone vascolare. Utilizzando una piccola siringa attaccata alla prima connessione dell'esca, far scorrere delicatamente il fluido attraverso l'arteria per garantirne la pervietà. Dopo aver fissato l'arteria all'inserto fabbricato, riempire lo spazio di reazione con mezzi di perfusione.
Successivamente, riempire con cura il circuito di circolazione luminale con i fluidi, rimuovendo l'aria residua dal sistema. Infine, collegare lo spazio di reazione al sistema di perfusione assemblato, completando la circolazione. Per eseguire la coltura di perfusione, posizionare il sistema di perfusione in un'incubatrice.
Dopo averlo collegato a una pompa peristaltica, collegare eventuali sistemi di acquisizione aggiuntivi, come i sensori di pressione. Lasciare che il sistema si equilibri durante la notte con una bassa portata del fluido di circa 10-15 millilitri al minuto. Il giorno seguente, aumentare gradualmente il flusso fino a raggiungere una portata finale di 35 millilitri al minuto.
Ogni tre giorni, sostituire il 50% del terreno collegando una siringa con terreno nuovo alla porta di scambio del terreno più vicina alla pompa e una siringa vuota alla porta più vicina al serbatoio per raccogliere il mezzo esausto. Dopo l'esperimento, utilizzando forbici chirurgiche sterili, prelevare il tessuto dalla camera di reazione tagliando le estremità del tessuto collegate al bioreattore. L'imaging confocale che utilizza marcatori endoteliali e specifici della muscolatura liscia ha rivelato che la normale struttura di un'arteria è stata ben conservata e mantenuta per tutto il tempo, a partire dal momento del prelievo, fino alla pulizia e alla lavorazione, e anche dopo la coltura di perfusione.
Tuttavia, una manipolazione errata durante la lavorazione ha provocato la perdita dell'endotelio prima della coltura e l'applicazione di condizioni di coltura non fisiologiche come l'inizio improvviso di un flusso elevato ha mostrato danni luminali. La valutazione istologica del tessuto mediante colorazione con ematossilina ed eosina e colorazione con immunofluorescenza al momento del prelievo e dopo sette giorni di coltura di perfusione ha rivelato che la morfologia e la distribuzione complessiva delle cellule nella parete del vaso sono state mantenute per tutto il tempo.
