Per iniziare, lavare le piccole vescicole extracellulari isolate o SEV due volte mediante ultracentrifugazione a 110.000 G e quattro gradi Celsius per 70 minuti. Risospendere le vescicole in 500 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS. Quindi, aggiungi cinque microlitri di inibitore della proteasi 100X.
Sottoporre il campione a frantumazione ultrasonica a 40 watt per 10 minuti, con un tempo ultrasonico di tre secondi e un intervallo di cinque secondi. Centrifugare la miscela tritata a 13.700 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al surnatante ottenuto, aggiungere ditiotreitolo ad una concentrazione finale di 50 millimolari.
E incubarlo a bagnomaria a 56 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi aggiungere 50 microlitri di iodoacetammide molare al surnatante. E lascialo reagire a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
Centrifugare la miscela a 13.700 g e quattro gradi Celsius per 15 minuti. E trasferire il surnatante contenente l'estratto peptidico grezzo in una provetta per ultracentrifuga da 10 kilodalton. Rimuovere le proteine dal peptide grezzo centrifugando la provetta di ultrafiltrazione a 13.700 G e quattro gradi Celsius per un'ora.
Essiccare l'effluente raccolto in un concentratore centrifugo sottovuoto a 45 gradi Celsius. Per la desalinizzazione, utilizzare acqua pura per spettrometria di massa come solvente per tutti i reagenti. Per prima cosa, sciogliere i peptidi secchi in 100 microlitri di acido trifluoracetico allo 0,1% o TFA e tenerlo da parte.
Quindi aggiungere 100 microlitri di acetonitrile puro a ciascuna colonna di desalinizzazione. Centrifugare le colonne a 400 G per tre minuti a temperatura ambiente ed eliminare l'effluente. Quindi aggiungere 100 microlitri di acetonitrile al 50% per colonna di desalinizzazione e ripetere la centrifugazione come accennato in precedenza prima di scartare l'effluente.
Successivamente, aggiungere 100 microlitri di TFA allo 0,1% a ciascuna colonna di dissalazione prima della centrifugazione come accennato in precedenza. Ancora una volta, scartare l'effluente. Ora, pipetta i peptidi di desalinizzazione nella colonna di desalinizzazione.
Centrifugare le colonne come accennato in precedenza per caricare il campione. Aggiungere nuovamente l'effluente recuperato alla colonna di desalinizzazione per ripetere il carico. Quindi, aggiungere 100 microlitri di TFA allo 0,1%.
Centrifugare come accennato in precedenza e scartare l'effluente. Infine, aggiungere 50 microlitri di acetonitrile al 50% contenente lo 0,1% di TFA al peptide nella colonna di desalinizzazione. Dopo la centrifusione, come accennato in precedenza, raccogliere l'effluente in una nuova provetta da centrifuga di grado di spettrometria di massa.
