Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Natural Science Foundation of China (3157270). Ringraziamo il Dr. Feng Shao (Istituto Nazionale di Scienze Biologiche, Cina) per aver fornito iBMDM.

1. Isolamento di piccole vescicole extracellulari
NOTA: Eseguire tutta la centrifugazione nei passaggi 1.1-1.11 a 4 °C.
<ol><li>Preparazione di siero fetale bovino privo di sEV (FBS): centrifugare FBS per una notte a 110.000 × g a 4 °C attraverso un'ultracentrifuga (vedere la tabella dei materiali) per rimuovere le sEV endogene. Raccogliere il surnatante, sterilizzarlo con un filtro con una membrana di ultrafiltrazione da 0,2 μm e conservarlo a -20 °C.</li>
	<li>Placcare circa 3 x 107 macrofagi derivati dal midollo osseo immortalizzato (iBMDM) su una piastra di coltura da 150 mm e aggiungere 20 mL di terreno di coltura DMEM (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Prima di raccogliere le sEV, scartare il supporto. Lavare le cellule una volta con PBS (soluzione salina tamponata con fosfato; Tabella dei materiali) e sostituirlo con un mezzo contenente il 10% di FBS privo di sEV.</li>
	<li>In base alle esigenze dell'esperimento, raccogliere il surnatante cellulare e trasferirlo in provette da centrifuga da 50 ml.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante cellulare a 300 × g per 10 minuti per rimuovere le cellule, scartare il pellet e trasferire il surnatante in nuove provette da centrifuga da 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante a 2000 × g per 10 minuti per rimuovere le cellule morte, scartare il pellet e trasferire il surnatante in nuove provette da centrifuga ad alta velocità (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Centrifugare il surnatante a 10.000 × g per 30 minuti attraverso una centrifuga ad alta velocità per rimuovere i detriti cellulari e le microvescicole, scartare il pellet e trasferire il surnatante in nuove provette per ultracentrifuga (vedere Tabella dei materiali). Il volume delle provette per ultracentrifuga aperte è di 38,6 mL; mettere 35 mL di surnatante cellulare in ciascuna provetta.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante a 110.000 × g per 70 minuti in una centrifuga a rotore a secchiello oscillante (vedere la tabella dei materiali) per ottenere pellet grezzo sEV.</li>
	<li>Scartare il surnatante e lavare il pellet arricchito con sEV con 1 mL di PBS. Centrifugare a 110.000 × g per 70 minuti su un'ultracentrifuga da tavolo (vedi Tabella dei materiali). Eliminare il surnatante e aggiungere 1 mL di PBS in una provetta per ultracentrifuga.</li>
	<li>Quindi pipettare il precipitato in modo continuo, trasferire 1 mL di PBS in un'altra provetta per ultracentrifuga e così via, fino a quando tutte le provette per ultracentrifuga non vengono miscelate mediante pipettaggio.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di PBS, che sono sEV.</li>
	<li>Misurare la proteina totale delle sEV utilizzando il metodo dell'acido bicinchoninico (BCA), seguendo i passaggi seguenti (vedere la tabella dei materiali).<ol><li>Preparazione dello standard proteico: Aggiungere 1,2 mL di soluzione di preparazione proteica in una provetta proteica standard (30 mg di BSA) per scioglierla completamente e preparare la soluzione standard proteica (25 mg/mL). Quindi diluirlo con PBS fino a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Aggiungere 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL e 20 μL dello standard proteico nella piastra a 96 pozzetti e aggiungere PBS per ottenere 20 μL. Allo stesso tempo, aggiungere 18 μL di tampone di lisi HEPES (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5% Triton X-100) e 2 μL di campioni di sEVs ai pozzetti del campione da testare.</li>
		<li>Preparare la soluzione di lavoro BCA richiesta secondo le istruzioni del produttore, aggiungere 200 μL di soluzione di lavoro BCA a ciascun pozzetto e porre a temperatura ambiente (RT) per 20-30 minuti.</li>
		<li>Misurare l'assorbanza alla lunghezza d'onda di 562 nm con un lettore per micropiastre e calcolare la concentrazione proteica totale delle sEV in base alla curva standard e al fattore di diluizione. NOTA: Le sEV estratte da 40 mL di surnatante con questo protocollo possono essere utilizzate per la successiva identificazione di marcatori proteici (western blot). Tuttavia, le sEV estratte da 200 mL di surnatante cellulare possono essere utilizzate sia per l'osservazione morfologica (microscopia elettronica a trasmissione, TEM) che per l'analisi granulometrica (analisi di tracciamento delle nanoparticelle, NTA). In particolare, per le sEV raccolte nella fase 1.11, risospendere con 100 μL di PBS. Prelevare 20-30 μL per l'osservazione morfologica (TEM) e risospendere il campione rimanente in 1 mL di PBS per l'analisi granulometrica (NTA). Tutte le centrifughe sono pre-raffreddate in anticipo. Per la fase 1.8, queste provette per ultracentrifuga devono essere rigorosamente bilanciate e piene per almeno tre quarti. In caso contrario, aggiungi del mezzo al trucco. Per la fase 1.11, le sEV possono essere conservate a 4 °C per un breve periodo (12 h); in caso contrario, devono essere conservati a -20 o -80 °C per evitare la degradazione delle proteine che interferisce con l'estrazione dei peptidi. Tuttavia, per i campioni utilizzati per osservare la morfologia e misurare la dimensione delle particelle, si consiglia di conservare solo a 4 °C per un breve periodo (12 ore).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Osservazione della morfologia delle sEV mediante microscopia elettronica a trasmissione
<ol><li>Posizionare una goccia di campione fresco di sEVs (circa 20-30 μL) sul parafilm, posizionare il lato numero della rete di rame sulla gocciolina di sEVs e lasciarlo assorbire per 3 minuti.</li>
	<li>Assorbire il liquido in eccesso con carta da filtro, quindi posizionare la griglia di rame su una goccia di acqua distillata e lavarla due volte.</li>
	<li>Assorbire il liquido in eccesso con carta da filtro. Quindi posizionare la griglia di rame sulla gocciolina di acetato di uranile allo 0,5% per la colorazione negativa per 5 s.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.2.</li>
	<li>Posizionare la rete di rame preparata sull'asta del campione e inserirla nella fase del campione.<ol><li>Regolare l'ingrandimento su 20.000x-25.000x per trovare il campione da testare. Quindi regolare l'ingrandimento a 100.000x e regolare la posizione e la scala di grigi appropriate da osservare al microscopio elettronico a trasmissione (TEM; Tabella dei materiali). La tensione di accelerazione per l'acquisizione delle immagini è impostata a 80 kV. NOTA: Per la fase 2.1, se la concentrazione di campioni di sEVs è bassa (<50 μg/μL), il tempo di adsorbimento può essere esteso a 5 minuti o anche di più. In alternativa, per la fase 1.10, è possibile utilizzare un volume minore di PBS (50 μL) per la risospensione. Per il passaggio 2.3, il tempo di colorazione negativa non deve essere troppo lungo; in caso contrario, è difficile osservare la struttura tridimensionale (3D) delle sEV.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Misure della distribuzione granulometrica e della concentrazione di sEV mediante analisi di tracciamento di nanoparticelle
<ol><li>Per le sEV raccolte nella fase 1.11, diluire la soluzione a 1 mL per l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Innanzitutto, pulire lo strumento con acqua distillata fino a quando non ci sono impurità nel campo visivo. Quindi utilizzare una siringa sterile da 1 mL per spingere lentamente il campione (volume di iniezione: 0,5-1 mL).</li>
	<li>Analizzare i campioni attraverso il software di supporto (vedere la tabella dei materiali). In particolare, fare clic su Avvia fotocamera e regolare il livello della fotocamera su una dimensione appropriata (generalmente un'intensità di 14-16 unità), quindi selezionare il metodo di misurazione, Misurazione standard (3 o 5 volte) e fare clic su Esegui per raccogliere le particelle.</li>
	<li>Dopo aver raccolto le particelle, il computer può osservare le particelle sEVs in movimento. Allo stesso tempo, impostare la soglia di rilevamento (generalmente 5) per analizzare la distribuzione granulometrica in modo che le particelle conteggiate finali siano tutte sEV in movimento piuttosto che sullo sfondo. Dopo aver analizzato le particelle, salvate ed esportate i risultati dell'analisi.</li>
	<li>Dopo l'uso, lavare lo strumento con acqua distillata fino a quando non ci sono particelle evidenti nel campo visivo e spegnere il laser. NOTA: A differenza dei campioni di sEV per TEM, i campioni di sEV per NTA non devono essere troppo concentrati e richiedono volumi di campione maggiori (almeno 1 mL). Inoltre, è possibile utilizzare metodi alternativi per analizzare la distribuzione dimensionale delle sEV, come la citometria a flusso e il rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili (TRPS), ecc. Il numero raccomandato di particelle/frame per le misurazioni NTA (NanoSight LM10) è 40.</li>
</ol>4. Rilevazione di marcatori proteici di sEVs mediante western blot
NOTA: Secondo le linee guida Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV) 201817,18, 5 categorie di proteine sono raccomandate per la caratterizzazione delle sEV. Valutare almeno un marcatore proteico di ciascuna categoria da 1 a 4 per la preparazione di sEV.
<ol><li>Per le sEV raccolte nella fase 1.9, pipettare con cura il surnatante e aggiungere 15 μL di tampone di lisi HEPES per 5 minuti. Quindi aggiungere una quantità uguale di tampone di carico e cuocere in acqua bollente per 15 min.</li>
	<li>In questo protocollo, il carico della proteina delle sEVs era di 8-10 μg. Elettroforesi delle proteine in gel al 10% ad una tensione costante di 80 V (circa 30 min).<ol><li>Quando il campione entra nel gel separatore, regolare la tensione a 120 V (circa 45 min). Dopo che il campione si trova a 2-3 cm di distanza dal fondo della lastra di vetro, scollegare l'alimentazione e tagliare la striscia del campione per l'elettroporazione. La composizione della soluzione per elettroforesi è descritta nel sottopassaggio 4.2.1.1.<ol><li>Per preparare una soluzione di elettroforesi 5x, pesare rispettivamente 15,1 g, 5 g e 94 g di Tris, SDS e glicina e diluire a 1 L con acqua deionizzata. Quando viene utilizzato, deve essere diluito 5 volte con acqua.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Assemblare il dispositivo di elettroporazione e mettere una soluzione di elettroporazione sufficiente (circa 1 L) ed elettroporare la proteina sulla membrana di nitrocellulosa (NC) con una corrente costante di 90 mA su ghiaccio per 3,5 ore. NOTA: Per preparare una soluzione di elettroporazione 10x, pesare rispettivamente 30,25 g e 144,1 g di Tris e glicina e diluire a 1 L con acqua deionizzata. Quando viene utilizzato, deve essere preparato in un rapporto di 7:2:1 di acqua deionizzata: metanolo: soluzione di elettroporazione.</li>
	<li>Dopo l'elettroporazione, porre la membrana NC in una soluzione bloccante (2,5 g di latte scremato in polvere in 50 mL di soluzione salina tamponata Tris con Tween 20 allo 0,1% (TBST) per 1-2 ore a RT o per una notte a 4 °C. La composizione del TBST è descritta nel sottopassaggio 4.4.1.<ol><li>Per preparare 10x TBST, pesare rispettivamente 60,56 g e 175,32 g di Tris e NaCl, quindi aggiungere 10 mL di Tween-20 e 34 mL di acido cloridrico concentrato. Regolare pH = 7,6 con acido cloridrico concentrato e trucco a 2 L con acqua deionizzata. Quando viene utilizzato, deve essere diluito dieci volte con acqua.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificare i marcatori proteici in base a tre marcatori di sEV (cluster di differenziazione 9 [CD9]; β-actina; gene di suscettibilità tumorale [TSG101]) e un marcatore di non-sEV (proteina 94 regolata dal glucosio [GRP94]).<ol><li>Pipettare 2 μL degli anticorpi di cui sopra e diluire a 1:500, quindi incubare le membrane NC a RT per 3 ore o per una notte a 4 °C. Il diluente è la soluzione bloccante del passaggio 4.4.</li>
		<li>Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, lavare 3 volte con 1x TBST su uno shaker per 10 minuti ogni volta.</li>
	</ol></li>
	<li>Inserire la membrana NC nell'anticorpo secondario diluito (1:500) e agitare lentamente su uno shaker a RT per 45-50 minuti. Lavalo 3 volte con 1x TBST su uno shaker per 10 minuti ogni volta.</li>
	<li>Miscelare i substrati chemiluminescenti A e B (vedere la tabella dei materiali) a 1:1, aggiungere il reagente miscelato alla membrana NC e incubare a RT per 5 minuti.</li>
	<li>Immagine della membrana NC utilizzando un blot imager (vedere la tabella dei materiali)<ol><li>Aprire il software Image Lab e selezionare Nuovo protocollo sperimentale.</li>
		<li>Selezionare l'applicazione Blotting-colorimetric, annullare Evidenziazione, fare clic su Esegui protocollo sperimentale, acquisire il marcatore e salvarlo.</li>
		<li>Quindi selezionare nuovamente il programma applicativo Blotting-chemi e impostare il numero totale di immagini e il tempo di esposizione rispettivamente su 30 s e 300 s.</li>
		<li>Fare clic su Esegui protocollo sperimentale, acquisire le immagini e salvarle. Infine, rimuovere la membrana NC e spegnere il computer. NOTA: Per la fase 4.6, il tempo di incubazione dell'anticorpo secondario non deve superare i 50 minuti; in caso contrario, lo sfondo sarà troppo scuro.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Estrazione dei peptidi delle sEV
<ol><li>Lavare le sEV due volte mediante ultracentrifugazione a 110.000 × g a 4 °C per 70 minuti, aggiungere 500 μL di PBS (vedere la tabella dei materiali) per risospenderle e aggiungere 5 μl di inibitore della proteasi 100x (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare il campione per la frantumazione ad ultrasuoni (vedere la tabella dei materiali). Le impostazioni per l'omogeneizzazione a ultrasuoni sono le seguenti: potenza: 40 W, tempo totale: 10 min, tempo ultrasonico: 3 s e tempo di intervallo: 5 s.</li>
	<li>Centrifugare la miscela tritata a 13.700 × g per 15 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, aggiungere ditiotreitolo (DTT; Tabella dei materiali) al surnatante fino ad una concentrazione finale di 50 mmol/L e incubare a bagnomaria a 56 °C per 30 min.</li>
	<li>Successivamente, aggiungere 50 μL di iodoacetammide (IAA; Tabella dei materiali) al surnatante ad una concentrazione di 1 mol/L e lasciarlo reagire a RT per 20 min al buio.</li>
	<li>Centrifugare la miscela a 13.700 × g a 4 °C per 15 minuti e raccogliere il surnatante, l'estratto di peptidi grezzi. Conservare a -20 °C per un uso successivo.</li>
	<li>Ultrafiltrare l'estratto grezzo di peptidi ottenuti con provette di ultrafiltrazione da 10 kDa19 (vedi Tabella dei Materiali) per rimuovere le proteine e centrifugare a 13.700 × g a 4 °C per 1 h. Raccogliere l'effluente ed essiccarlo in un concentratore centrifugo sottovuoto (vedi Tabella dei Materiali) a 45 °C.</li>
	<li>Dissalare i campioni essiccati seguendo i passaggi 5.8.1-5.8.8. Utilizzare acqua pura per spettrometria di massa come solvente per i reagenti.<ol><li>Aggiungere 100 μL di acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1% a ciascun campione per sciogliere completamente i peptidi essiccati.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di acetonitrile al 100% (ACN) a ciascuna colonna di desalinizzazione, centrifugare a 400 × g per 3 minuti a RT ed eliminare l'effluente. Quindi aggiungere 100 μL di ACN al 50%, centrifugare a 400 × g per 3 minuti e scartare l'effluente.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di TFA allo 0,1% a ciascuna colonna di desalinizzazione, centrifugare a 400 × g per 3 minuti e scartare l'effluente.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 5.8.3.</li>
		<li>Pipettare i peptidi disciolti nella fase 5.8.1 nella colonna di desalinizzazione, centrifugare a 400 × g per 3 minuti e recuperare l'effluente. Ripetere la fase di caricamento del campione per consentire al campione peptidico di adsorbire la colonna di desalinizzazione.</li>
		<li>Ripetere due volte il passaggio 5.8.3.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL di ACN al 50% (contenente lo 0,1% di TFA) alla colonna di desalinizzazione, centrifugare a 400 × g per 3 minuti e raccogliere l'effluente (peptidi) in una nuova provetta da centrifuga per spettrometria di massa.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Essiccazione dei peptidi dissalati
<ol><li>Essiccare i peptidi dissalati in un concentratore centrifugo sottovuoto (Impostazioni: modalità V-AQ , temperatura: 45 °C e tempo: 50 min) e utilizzarli per la successiva analisi di spettrometria di massa. NOTA: Il processo di estrazione dei peptidi delle sEV deve essere eseguito il più possibile su ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine. Tutti i reagenti utilizzati sono stati preparati con acqua di spettrometria di massa per evitare la contaminazione da plastica. Per la fase 5.8, la desalinizzazione comporta l'inevitabile perdita dei campioni peptidici. Questa perdita può essere ridotta ripetendo i passaggi 5.8.5 e 5.8.7.</li>
</ol>7. Cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS)
NOTA: Analizzare il campione dei peptidi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS), in particolare lo spettrometro di massa Orbitrap Q Exactive HF-X collegato a un sistema LC a nano-alte prestazioni EASY-nLC 1000 (vedere la tabella dei materiali).
<ol><li>Separare i campioni su una colonna analitica C18 (1,9 μm di diametro del grano, 15 cm di lunghezza x 150 μm di diametro interno) a una velocità di flusso di 60 nL/min con un gradiente di 65 min: 4%-15% per 4 min, 15%-28% per 28 min, 28%-40% per 10 min, 40%-69% per 10 min, 95% costante per 7 min, Il 95% è diminuito al 6% per 1 minuto e costante per 5 minuti (solvente A, acqua contenente lo 0,1% di acido formico [FA]; solvente B, acetonitrile all'80% contenente lo 0,1% di FA, v/v).</li>
	<li>Ionizzare i peptidi eluiti in uno spruzzatore a ionizzazione nano-elettrospray (nano-ESI) a una temperatura capillare di 320 °C e una tensione di spruzzo di 2,2 kV.</li>
	<li>Raccogli i dati spettrali di massa utilizzando la modalità di acquisizione dipendente dai dati con un potere di risoluzione di 120.000 per la modalità a scansione completa e 15.000 in modalità MS /MS .<ol><li>Eseguire scansioni complete nell'orbitrap dall'intervallo di scansione da 250 m/z a 1800 m/z e finestra di isolamento con 1,6 m/z.</li>
		<li>Selezionare i primi 20 ioni intensi per la frammentazione della dissociazione collisionale (HCD) ad alta energia con un'energia di collisione normalizzata del 29% e misurarli nel separatore di ioni. NOTA: Le condizioni tipiche della spettrometria di massa erano le seguenti: i target di controllo automatico del guadagno (AGC) erano 3 x 106 ioni per le scansioni complete e 2 x 105 per le scansioni MS/MS; il tempo massimo di iniezione è stato di 80 ms per le scansioni complete e di 19 ms per le scansioni MS/MS; e l'esclusione dinamica è stata utilizzata per 13 s.</li>
	</ol></li>
</ol>

Isolamento di piccole vescicole extracellulari ed estrazione del loro peptidoma

<ol>
	<li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+PD-L1+contributes+to+immunosuppression+and+is+associated+with+anti-PD-1+response.">Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response.</a> Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).</li><li>Ti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-preconditioned+mesenchymal+stromal+cells+modify+macrophage+polarization+for+resolution+of+chronic+inflammation+via+exosome-shuttled+let-7b.">LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+S100A4+derived+from+highly+metastatic+hepatocellular+carcinoma+cells+promotes+metastasis+by+activating+STAT3.">Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).</li><li>Xun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-derived+exosomal+miR-138-5p+modulates+polarization+of+tumor-associated+macrophages+through+inhibition+of+KDM6B.">Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B.</a> Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).</li><li>Tai, Y. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+bioactive+peptides+for+biomaterials+design+and+therapeutics.">Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics.</a> Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+proteolysis+of+bioactive+peptides+using+a+peptidomics+approach.">Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach.</a> Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).</li><li>Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidome:+Chaos+or+inevitability.">Peptidome: Chaos or inevitability.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).</li><li>Keller, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+exosomes+provide+protection+against+bacterial+toxins.">Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins.</a> Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).</li><li>Koeppen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7b-5p+in+vesicles+secreted+by+human+airway+cells+reduces+biofilm+formation+and+increases+antibiotic+sensitivity+of+P.+aeruginosa.">Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Quando si studia la funzione delle sEV, è imperativo ottenere sEV ad alta purezza da campioni biologici complessi per evitare potenziali contaminazioni. È stata sviluppata una varietà di metodi per l'isolamento delle sEV13 e, tra questi metodi, i metodi basati sull'ultracentrifugazione differenziale hanno mostrato una purezza relativamente elevata delle sEV. In questo studio, sono stati raccolti 200 mL di surnatante cellulare per 6 ore e circa 200-300 μg di sEV sono stati ottenuti mediante ult...

Piccole vescicole extracellulari (sEV) con un diametro inferiore a 200 nm sono presenti in quasi tutti i tipi di fluidi corporei e secrete da tutti i tipi di cellule, tra cui urina, sudore, lacrime, liquido cerebrospinale e liquido amniotico1. Inizialmente, le sEV erano considerate come contenitori per lo smaltimento dei rifiuti cellulari, il che ha portato a una ricerca minima nel decennio successivo2. Recentemente, prove crescenti indicano che le sEV contengono proteine, lipidi, acidi nucleici e altri metaboliti specifici. Queste molecole vengono trasportate alle cellule bersaglio3, contribuendo alla comunicazione intercellulare, attraverso la quale partecipano a vari processi biologici, come la riparazione dei tessuti, l'angiogenesi, l'immunità4 e l'infiammazione 5,6, lo sviluppo del tumore e le metastasi 7,8,9, ecc.
Per facilitare lo studio delle sEV, è imperativo isolare le sEV da campioni complessi. Sono stati sviluppati diversi metodi di isolamento delle sEV sulla base delle proprietà fisiche e chimiche delle sEV, come la loro densità, la dimensione delle particelle e le proteine marcatrici di superficie. Queste tecniche includono metodi basati sull'ultracentrifugazione, metodi basati sulla dimensione delle particelle, metodi basati sulla cattura dell'immunoaffinità, metodi basati sulla precipitazione delle sEV e metodi basati sulla microfluidica10,11,12. Tra queste tecniche, il metodo basato sull'ultracentrifugazione è ampiamente riconosciuto come il gold standard per l'isolamento delle sEV ed è la tecnica più comunemente utilizzata13.
Una quantità crescente di prove suggerisce la presenza di una moltitudine di peptidi biologicamente attivi non ancora scoperti nei peptidomi di vari organismi. Questi peptidi contribuiscono in modo significativo a numerosi processi fisiologici regolando la crescita, lo sviluppo, la risposta allo stress 14,15 e la trasduzione del segnale16. L'obiettivo del peptidoma delle sEV è quello di scoprire i peptidi trasportati da queste sEV e fornire indizi sulle loro funzioni biologiche. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento delle sEV attraverso l'ultracentrifugazione differenziale, seguita dall'estrazione di peptidi da queste sEV per un'ulteriore analisi del loro peptidoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Beyotime Technology</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td>Beyotime Technology</td>
			<td>AF1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357003</td>
			<td>High-speed centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8220</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Cell World</td>
			<td>N?A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRP94</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>20292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti JXN-26</td>
			<td>Centrifuge rotor (JA-25.50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)</td>
			<td>National Institute of Biological Sciences, China</td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l1149</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td>1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-high-performance LC system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EASY-nLC 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight NTA3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td>Ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Bimake</td>
			<td>B14002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Concentrator plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima MAX-XP</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor (TLA 55)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AF8258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Scientz</td>
			<td>SCIENTZ-IID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDocXRs</td>
			<td>Image lab 4.0 (beta 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3853</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of peptides of small extracellular vesicles from bone marrow-derived macrophages

Piccole vescicole extracellulari (sEV) sono tipicamente secrete dall'esocitosi dei corpi multivescicolari (MVB). Queste nanovescicole con un diametro di <200 nm sono presenti in vari fluidi corporei. Queste sEV regolano vari processi biologici come la trascrizione e la traduzione genica, la proliferazione e la sopravvivenza cellulare, l'immunità e l'infiammazione attraverso i loro carichi, come proteine, DNA, RNA e metaboliti. Attualmente, sono state sviluppate varie tecniche per l'isolamento delle sEV. Tra questi, il metodo basato sull'ultracentrifugazione è considerato il gold standard ed è ampiamente utilizzato per l'isolamento delle sEV. I peptidi sono naturalmente biomacromolecole con meno di 50 amminoacidi di lunghezza. Questi peptidi partecipano a una varietà di processi biologici con attività biologica, come ormoni, neurotrasmettitori e fattori di crescita cellulare. Il peptidome ha lo scopo di analizzare sistematicamente peptidi endogeni in specifici campioni biologici mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Qui, abbiamo introdotto un protocollo per isolare le sEV mediante ultracentrifugazione differenziale e abbiamo estratto il peptidoma per l'identificazione mediante LC-MS/MS. Questo metodo ha identificato centinaia di peptidi derivati da sEVs da macrofagi derivati dal midollo osseo.

Small extracellular vesicles (sEVs) with a diameter of less than 200 nm are present in almost all types of body fluids and secreted by all kinds of cells, including urine, sweat, tears, cerebrospinal fluid, and amniotic fluid1. Initially, sEVs were considered as receptacles for disposing of cellular waste, which led to minimal research in the subsequent decade2. Recently, increasing evidence indicates that sEVs contain specific proteins, lipids, nucleic acids, and other metabolites. These molecules are transported to target cells3, contributing to intercellular communication, through which they participate in various biological processes, such as tissue repair, angiogenesis, immunity4 and inflammation5,6, tumor development and metastasis7,8,9, etc.
To facilitate the study of sEVs, it is imperative to isolate sEVs from complex samples. Different sEVs isolation methods have been developed based on the physical and chemical properties of sEVs, such as their density, particle size, and surface marker proteins. These techniques include ultracentrifugation-based methods, particle size-based methods, immunoaffinity capture-based methods, sEVs precipitation-based methods, and microfluidics-based methods10,11,12. Among these techniques, the ultracentrifugation-based method is widely recognized as the gold standard for sEVs isolation and is the most commonly used technique13.
An increasing amount of evidence suggests the presence of a multitude of undiscovered biologically active peptides in the peptidomes of various organisms. These peptides significantly contribute to numerous physiological processes by regulating growth, development, stress response14,15, and signal transduction16. The objective of sEVs&#39; peptidome is to uncover the peptides carried by these sEVs and provide clues to their biological functions. Here, we present a protocol of isolating sEVs through differential ultracentrifugation, followed by extraction of peptides from these sEVs for further analysis of their peptidome.

Autore in primo piano: Estrazione di peptidomi da piccole vescicole extracellulari isolate da macrofagi derivati dal midollo osseo 

Identificazione di peptidi di piccole vescicole extracellulari da macrofagi derivati dal midollo osseo

We explore the functional roles of extracellular vesicles in innate immunity. We have developed a protocol to isolate small extracellular vesicles, or sEVs, via differential ultracentrifugation and identify the peptidome by LC-MS/MS, revealing the key biological functions of the peptides in sEVs. The extracellular vesicles have been shown to mediate intercellular communication by transporting cargo to recipient cells, such as proteins, lipids, and nucleic acids.By releasing antimicrobial components, they act the first line of defense against invading microbes in innate immunity. While differential ultracentrifugation yields highly pure small extracellular sEVs, it can be time-consuming and often results in low yields. In our study, these are major challenges for the stable identification of low-abundance peptides in the sEVs.

Per le sEV isolate mediante ultracentrifugazione differenziale (Figura 1), ne abbiamo valutato la morfologia, la distribuzione granulometrica e i marcatori proteici secondo l'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)17.
In primo luogo, la morfologia delle sEV è stata osservata mediante TEM, mostrando una tipica struttura a coppa (Figura 2A). L'NTA ha mostrato che le sEV isolate erano per lo più ...

Watch this Scientific Journal Video about Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages at JoVE.com

Questo protocollo descrive una procedura per isolare piccole vescicole extracellulari dai macrofagi mediante ultracentrifugazione differenziale ed estrarre il peptidoma per l'identificazione mediante spettrometria di massa.

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...

Esploriamo i ruoli funzionali delle vescicole extracellulari nell'immunità innata. Abbiamo sviluppato un protocollo per isolare piccole vescicole extracellulari, o sEV, tramite ultracentrifugazione differenziale e identificare il peptidoma mediante LC-MS/MS, rivelando le funzioni biologiche chiave dei peptidi nelle sEV. È stato dimostrato che le vescicole extracellulari mediano la comunicazione intercellulare trasportando il carico alle cellule riceventi, come proteine, lipidi e acidi nucleici.Rilasciando componenti antimicrobici, agiscono sulla prima linea di difesa contro i microbi invasori nell'immunità innata. Sebbene l'ultracentrifugazione differenziale produca piccole sEV extracellulari altamente pure, può richiedere molto tempo e spesso si traduce in basse rese. Nel nostro studio, queste sono le principali sfide per l'identificazione stabile di peptidi a bassa abbondanza nelle sEV.

identification-peptides-small-extracellular-vesicles-from-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

1.2K Views.  Anhui Medical University. Esploriamo i ruoli funzionali delle vescicole extracellulari nell'immunità innata. Abbiamo sviluppato un protocollo per isolare piccole vescicole extracellulari, o sEV, tramite ultracentrifugazione differenziale e identificare il peptidoma mediante LC-MS/MS, rivelando le funzioni biologiche chiave dei peptidi nelle sEV. È stato dimostrato che le vescicole extracellulari mediano la comunicazione intercellulare trasportando il carico alle cellule riceventi, come proteine, lipidi e acidi nucle...

Video: Autore in primo piano: Estrazione di peptidomi da piccole vescicole extracellulari isolate da macrofagi derivati dal midollo osseo 

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of &lt;200 nm are present in various body fluids. These sEVs regulate various biological processes such as gene transcription and translation, cell proliferation and survival, immunity and inflammation through their cargos, such as proteins, DNA, RNA, and metabolites. Currently, various techniques have been developed for sEVs isolation. Among them, the ultracentrifugation-based method is considered the gold standard and is widely used for sEVs isolation. The peptides are naturally biomacromolecules with less than 50 amino acids in length. These peptides participate in a variety of biological processes with biological activity, such as hormones, neurotransmitters, and cell growth factors. The peptidome is intended to systematically analyze endogenous peptides in specific biological samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Here, we introduced a protocol to isolate sEVs by differential ultracentrifugation and extracted peptidome for identification by LC-MS/MS. This method identified hundreds of sEVs-derived peptides from bone marrow-derived macrophages.

This protocol describes a procedure to isolate small extracellular vesicles from macrophages by differential ultracentrifugation and extract the peptidome for identification by mass spectrometry.

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Biochimica

Isolating Small Extracellular Vesicles (sEVs) by Differential Ultracentrifugation

Isolating Small Extracellular Vesicles (SEVs) by Differential Ultracentrifugation  

To begin, centrifuge FBS overnight in an ultracentrifuge at 110, 000 G and four degrees Celsius to remove the endogenous sEVs. Sterilize the supernatant by filtering it through a 0.2 micron ultrafiltration membrane to yield sEVs-free FBS. Next in a 150 millimeter culture dish, plate about 3 times 10 to the seventh immortalized bone-marrow-derived macrophages in 20 milliliters of DMEM culture medium.Incubate the dish at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide overnight prior to collecting the sEVs from the macrophages. The next day, after discarding the medium, wash the cells with phosphate-buffered saline or PBS. Replace the medium with DMEM containing 10%sEVs-free free fetal bovine serum before incubating the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.Based on the experiment's requirements, collect and transfer the cells'supernatant to 50 milliliter centrifuge tubes. Centrifuge the tubes at 300 G for 10 minutes to remove the cells. Transfer the result in supernatant from each tube to a new 50 milliliter centrifuge tube and discard the pellet.This time, centrifuge the supernatant at 2000 G for 10 minutes to remove dead cells. Then transfer the supernatant to new high-speed centrifuge tubes and discard the pellets. Next to remove debris and microvesicles, centrifuge the obtained supernatant at 10, 000 G for 30 minutes using a high-speed centrifuge.Transfer the resulting supernatant to new ultracentrifuge tubes by adding 35 milliliters in each tube and discarding the pellets. Centrifuge the ultracentrifuge tubes in a swinging bucket rotor centrifuge at 110, 000 G for 70 minutes before discarding the supernatant. Wash the resulting crude sEVs-enriched pellet with one milliliter of PBS.Again, add one milliliter of PBS to the washed pellet in one of the tubes, and mix by pipetting continuously. Transfer the one milliliter of resultant PBS suspension to another tube containing the pellet, and repeat the same until all pellets in the tubes are mixed by pipetting. Transfer the resultant one milliliter of sEVs-rich PBS to a new ultracentrifuge tube.Then centrifuge the new tube in a tabletop ultracentrifuge at 110, 000 G for 70 minutes. After discarding the supernatant, wash the resulting crude sEVs-enriched pellet with 100 microliters of PBS. Add 1.2 milliliters of protein preparation solution in a standard protein tube to dissolve the 30 milligrams of BSA present in it.Dilute the resulting protein standard solution with PBS to reduce its concentration from 25 to 0.5 milligrams per milliliter. Add eight different volumes of the diluted protein standard solution into wells of a 96-well plate, and bring the volume to 20 microliters in each well using PBB. Add 18 microliters of HEPES lysis buffer to the sample wells, followed by the addition of two microliters of the sEVs samples.Next, add 200 microliters of BCA working solution prepared per the manufacturer's instructions into each well. Allow the plate to rest at room temperature for 20 to 30 minutes. Finally, measure the absorbance at 562 nanometers using a microplate reader.Calculate the total protein content in the sEVs using the obtained results. The transmission electron microscopy images of the isolated sEVs displayed a typical cup-like morphology. Nanoparticle tracking analysis showed that the isolated sEVs were mostly concentrated at 136 nanometers.Western blot showed that isolated sEVs were significantly enriched of sEVs markers, including CD9, beta-actin, and TSG101. The endoplasmic reticulate marker GRP94 was only detected in the whole-cell lysate. The results indicated that the method employed yielded sEVs with a high level of purity.

Isolare piccole vescicole extracellulari (sEV) mediante ultracentrifugazione differenziale

Extraction of Peptides from Isolated Small Extracellular Vesicles (sEVs)

To begin, wash the isolated small extracellular vesicles or SEVs twice by ultracentrifugation at 110, 000 G and four degrees Celsius for 70 minutes. Re-suspend the vesicles in 500 microliters of phosphate buffered saline or PBS. Then, add five microliters of 100X protease inhibitor to it.Subject the sample to ultrasonic crushing at 40 watts for 10 minutes, with three second ultrasonic time, and five second interval time. Centrifuge the crushed mixture at 13, 700 G for 15 minutes at four degrees Celsius. To the obtained supernatant, add dithiothreitol to a final concentration of 50 millimolar.And incubate it in a water bath at 56 degrees Celsius for 30 minutes. Then add 50 microliters of one molar iodoacetamide to the supernatant. And allow it to react at room temperature for 20 minutes in the dark.Centrifuge the mixture at 13, 700 G and four degrees Celsius for 15 minutes. And transfer the supernatant containing the crude peptide extract to a 10 kilodalton ultracentrifuge tube. Remove protein from the crude peptide by centrifuging the ultra filtration tube at 13, 700 G and four degrees Celsius for one hour.Dry the collected effluent in a vacuum centrifugal concentrator at 45 degrees Celsius. For desalting, use mass spectrometry grade pure water as a solvent for all reagents. First, dissolve the dry peptides in 100 microliters of 0.1%trifluoracetic acid or TFA, and keep it aside.Then add 100 microliters of pure acetonitrile to each desalting column. Centrifuge the columns at 400 G for three minutes at room temperature, and discard the effluent. Then add 100 microliters of 50%acetonitrile per desalting column, and repeat the centrifugation as mentioned previously before discarding the effluent.Next, add 100 microliters of 0.1%TFA to each desalting column before centrifuging as mentioned previously. Once again, discard the effluent. Now, pipet the desalt peptides into the desalting column.Centrifuge the columns as mentioned previously to load the sample. Add the recovered effluent back to the desalting column to repeat the loading. Then, add 100 microliters of 0.1%TFA.Centrifuge as mentioned previously, and discard the effluent. Finally, add 50 microliters of 50%acetonitrile containing 0.1%TFA to the peptide in the desalting column. After centrifusion, as mentioned previously, collect the effluent in a new mass spectrometry grade centrifuge tube.