Treatment of the Monocyte-Derived Dendritic Cells (Mo-DCs) with Sialidase

Raccogliere circa 10 volte 10 fino alla sesta cellula dendritica derivata da monociti umani differenziata dai monociti. Dai 10 pozzetti della piastra da 24 pozzetti con 1,3 volte 10 alla sesta cellula per pozzetto, trasferirli in una nuova provetta conica sterile da 15 millilitri. Dopo aver centrifugato le cellule a 300 G per cinque-sette minuti a temperatura ambiente, utilizzando la normale pausa, scartare il surnatante per rimuovere le cellule morte e i detriti.

Aggiungere 10 millilitri di terreno RPMI 1640 contenente 11,1 millimolari di glucosio nella provetta. Dopo aver centrifugato a temperatura ambiente per quattro minuti a 300 G, utilizzando la normale pausa, scartare nuovamente il surnatante. Aggiungere due millilitri di terreno RPMI 1640 al pellet cellulare e dividere un millilitro della sospensione cellulare in due nuove microprovette sterili etichettate come numero uno e numero due.

Al microtubo uno, aggiungere 500 milli unità di Sialidasi da Clostridium perfringens. Incubare entrambe le provette per 60 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, trasferire le cellule da entrambe le microprovette in nuove provette coniche da 15 millilitri etichettate come numero uno e numero due.

Quindi aggiungere circa quattro millilitri di terreno RPMI 1640 completo contenente il 10% di FBS a ciascuna provetta conica. Centrifugare le provette a temperatura ambiente per quattro minuti a 300 G utilizzando la normale pausa e aggiungere cinque millilitri di terreno RPMI 1640 completo al pellet. Placcare un millilitro di cellule per pozzetto.

L'efficacia del trattamento con sailidasi per ridurre il contenuto di acido sialico sulla superficie delle cellule dendritiche derivate da monociti umani è stata valutata mediante citometria a flusso e microscopia confocale. Il trattamento con sailidasi ha ridotto significativamente il legame della lectina di Maackia Amurensis e della lectina di Sambucus nigra, aumentando al contempo la colorazione della lectina dell'agglutinina delle arachidi. La diminuzione della colorazione della lectina di Sambucus nigra dopo il trattamento con Sailidase ha mostrato una colorazione di lectina di Sambucus nigra significativamente ridotta sulla superficie della cellula.