Per iniziare, accendi il microscopio, la sorgente luminosa, la fotocamera e il sistema di aspirazione. Per il lavaggio del sistema di perfusione, utilizzare la soluzione di Ringer nella prima camera e la soluzione di zinco di Ringer integrata con piritione nella seconda camera. Dopo aver chiuso il rubinetto, riempire le camere con le stesse soluzioni.
Per iniziare la preparazione del campione, posizionare la camera di perfusione con il lato stretto della scanalatura rivolto verso l'alto e applicare un silicone sigillante attorno alla scanalatura. Quindi, usando una pinzetta fine, trasferisci un vetrino coprioggetti da 13 millimetri dalla soluzione di lavaggio sopra la scanalatura con le celle rivolte verso il basso. Posiziona un vetrino coprioggetto da 22 millimetri sopra il vetrino coprioggetto da 13 millimetri e stringilo con la pinzetta, facendo attenzione a non rompere i vetrini coprioggetti.
Capovolgere la camera e premerla per rilasciare i liquidi. Quindi, riempire la scanalatura con 100 microlitri di soluzione di lavaggio Ringer e premere di nuovo, assicurandosi che non ci siano perdite. Montare e fissare la camera di perfusione sulla piattaforma.
Quindi, collegare i tubi di perfusione e aspirazione per la perfusione sulle cellule nella scanalatura. Modificare la velocità di perfusione a circa due millilitri al minuto e attivare la perfusione della soluzione di Ringer. Per le misurazioni, aprire il software di imaging.
Impostare l'ingrandimento del microscopio su 10X utilizzando il pulsante laterale sinistro del microscopio. Dopo aver scelto Live View, utilizzate il joystick per spostare la piattaforma e concentrarvi sulle celle nel solco. Selezionare la lunghezza d'onda appropriata per mCherry.
Una volta che le celle sono state messe a fuoco, spostare la piattaforma per la selezione delle patch di celle appropriate. Seleziona il menu a discesa Disegna ROI. Scegli Disegna ROI circolari e disegna ROI su cluster di celle con le celle che esprimono mCherry.
Crea nuove ROI oltre la prima tenendo premuto il pulsante Maiusc e quindi premendo e trascinando le ROI esistenti. Seleziona Disegna ROI di sfondo quadrato dal menu a discesa e regola la posizione e le dimensioni della ROI di sfondo in cui non sono presenti celle. Dopo aver verificato l'assenza di celle nel ROI in background, vai alla scheda Acquisizione ND.
Selezionare la sottoscheda Lunghezza d'onda e contrassegnare la relativa casella di controllo. Assicurarsi che sia selezionata anche la casella di controllo per la lunghezza d'onda GFP. Fare clic sulla sottoscheda Tempo e definire l'intervallo di misurazione ogni cinque secondi e la durata come 30 minuti.
Sul pannello del microscopio, premere il tasto On per abilitare il Perfect Focus System, o PFS. In Acquisizione ND, assicurarsi che PFS on sia selezionato. Regola lo stato attivo e fai clic su Esegui ora.
Iniziare la misurazione del periodo basale per 90 secondi utilizzando la perfusione della soluzione di Ringer. Dopo 90 secondi, passare dalla perfusione della soluzione di Ringer alla perfusione della soluzione di zinco di Ringer e fare clic sulla bandiera rossa in basso a destra del pannello di interfaccia principale una volta che l'aumento della fluorescenza inizia a saturarsi. Tornare alla perfusione con la soluzione di Ringer fino allo scadere del tempo dell'esperimento.
Per esportare i dati con la sottrazione della linea di base, premere il pulsante Correzione sfondo e visualizzare le modifiche nella finestra Acquisizione ND. Fare clic sul pulsante Esporta per salvare i dati nella posizione desiderata. Un aumento della fluorescenza è derivato dall'aumento della concentrazione intracellulare di zinco, mentre una diminuzione ha indicato l'attività di ZnT-1 che trasporta lo zinco attraverso la membrana cellulare.
Il wild type ZnT-1 aveva una curva di fluorescenza più liscia rispetto al mutante, in relazione alla variabilità delle risposte cellulari al carico di zinco. Un box plot che confronta le attività di USCTD wild-type e delta ha mostrato tassi di trasporto medi simili, indicando una mancanza di differenza tra il wild type e il mutante. Tuttavia, la differenza nello spread può indicare una differenza funzionale.
