Iniziare posizionando le carcasse larvali di drosophila marcate con anticorpi allo 0,2% di PBST su un vetrino. Regolato al microscopio stereoscopico, assicurandosi che la superficie interna della carcassa larvale sia rivolta verso l'alto. Assorbire la soluzione PBST in eccesso con una salvietta.
Quindi aggiungere delicatamente una goccia di mezzo di montaggio anti-dissolvenza. Successivamente, posizionare un vetrino coprioggetto sul vetrino coprendo le larve sezionate lentamente e delicatamente, evitando la formazione di bolle. Fissare il vetrino coprioggetto in posizione applicando lo smalto per unghie intorno ai bordi.
Conservare il vetrino in un luogo buio per ridurre al minimo l'attenuazione della fluorescenza. Per l'acquisizione delle immagini, utilizzare il microscopio confocale a scansione laser con l'obiettivo a immersione in olio 63x. Quindi regolare la lunghezza d'onda e la potenza del laser per soddisfare al meglio i requisiti dell'esperimento.
Per identificare le giunzioni neuromuscolari e acquisire immagini del muscolo quattro nel segmento A tre, selezionare un laser a 488 nanometri per attivare l'alfa tubulina o Futsch e 546 nanometri per attivare la traccia di imaging HRP. Modificare i parametri per ottenere una dimensione del fotogramma di 1.024 x 1.024 pixel, uno zoom digitale di 1,0 e un intervallo di imaging di 0,8 micrometri. Per visualizzare i microtubuli nel muscolo, cattura immagini del muscolo due nei segmenti da A tre a A cinque poiché ha meno rami tracheali.
Scegli un laser a 488 nanometri per attivare l'alfa tubulina e un laser a 633 nanometri per attivare la traccia di imaging T3605. Regolare i parametri di imaging su una dimensione del fotogramma di 1.024 x 1.024 pixel, uno zoom digitale di 2,0 e un intervallo di imaging di 0,4 micrometri. Sia le organizzazioni pre che post-sinaptiche dei microtubuli della giunzione neuromuscolare sono state marcate con tubulina anti-alfa.
La colorazione di Futsch rifletteva l'abbondanza di microtubuli stabili nei neuroni pre-sinaptici. Una diminuzione dell'intensità del segnale dell'anti-Futsch è stata osservata quando i microtubuli che recidevano la proteina Katanin 60 erano sovraespressi nei neuroni presinaptici. L'intensità della colorazione del tronco dell'assone era più forte di quella dei rami.
Le mutazioni della katanina 60 hanno provocato un aumento delle anse dei microtubuli. La sovraespressione di Katanina 60 ha causato brevi frammenti di microtubuli all'interno dei pulsanti terminali. La colorazione con alfa tubulina ha dimostrato una chiara rete di microtubuli intorno al nucleo.
Le cellule muscolari avevano un'intensità microtubulare perinucleare significativamente aumentata e mostravano fasci più forti nel mutante Katanin 60. La sovraespressione ha provocato la frammentazione delle fibre dei microtubuli.
