IPSC Differentiation into Posterior Primitive Streak and Nephrogenic Intermediate Mesoderm

Iniziare lavando le cellule staminali pluripotenti indotte o iPSC sulla piastra a 6 pozzetti rivestita di matrice di membrana con due millilitri di DPBS. Aspirare il DPBS con una pipetta. Successivamente, aggiungere un millilitro della soluzione di distacco cellulare disponibile in commercio per staccare le iPSC.

Quindi posizionare la cellula in un'incubatrice a 37 gradi per cinque minuti. Ora pipettare un millilitro di mTeSR sulle iPSC, assicurandosi che le cellule si siano separate dalla superficie di plastica. Centrifugare queste cellule a 400 g per tre minuti a temperatura ambiente.

Risospendere il pellet cellulare, quindi contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, seminare una gamma di densità cellulari su una piastra a 6 pozzetti rivestita con una matrice di membrana. Colmateli con mTeSR integrato con 10 inibitori micromolari della Rho-chinasi.

Coltivare le piastre per una notte in un'incubatrice ad anidride carbonica impostata a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo aspirare l'mTeSR e lavare le cellule con due millilitri di DPBS. Successivamente, aggiungi due millilitri di terreno di fase 1 alle cellule.

Quindi mettere le cellule in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per quattro giorni. Il quarto giorno, rimuovere il terreno di fase 1 e lavare le cellule con due millilitri di DPBS. Quindi aggiungere due millilitri di terreno di fase 2 alle cellule prima di incubare le cellule come prima.

Dal giorno zero al quarto giorno, le iPSC si sono espanse rapidamente e hanno assunto forme romboidali o triangolari. La confluenza ha raggiunto il 90-100% e si è accumulata uniformemente fino al settimo giorno. Dopo la coltura in sospensione, gli aggregati formano spontaneamente strutture nefroniche dopo essersi dissociati il settimo giorno.