Generating Kidney Organoids from Induced Pluripotent Stem Cell Suspension Culture

Iniziare rimuovendo il terreno di stadio II dalla sospensione cellulare iPSC il settimo giorno di coltura. Ora lavate le celle con due millilitri di DPBS. Pipettare un millilitro di soluzione per il distacco cellulare a ciascun pozzetto.

Quindi posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi per cinque minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di terreno di stadio II alle cellule e mescolare accuratamente fino a quando le cellule non si sono staccate dalla superficie. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri, quindi centrifugarla a 400 g per tre minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di terreno di stadio III. Mescolare delicatamente la soluzione. Ora semina la sospensione in una piastra a sei pozzetti, a bassa aderenza, con un rapporto di uno a tre.

Posizionare la piastra su un agitatore orbitale in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Per rimuovere il terreno nella coltura in sospensione, tagliare prima la punta di una pipetta da un millilitro utilizzando forbici asettiche. Quindi agitare delicatamente la piastra a sei pozzetti per centralizzare gli organoidi.

Quindi, aspirare gli organoidi con le pipette preparate e metterli in una provetta da 15 millilitri, lasciandoli riposare per cinque minuti. Aspirare il surnatante, assicurandosi che gli organoidi rimangano alla base della provetta. Quindi pipettare il terreno di fase III nella piastra.

Pipettare la miscela per risospendere gli organoidi. Riplaccare gli organoidi in una piastra a sei pozzetti a bassa adesione. Continuare ad agitare la piastra a bassa aderenza a 60 rotazioni al minuto nell'incubatrice.

Il 12° giorno, sostituire il terreno con il terreno di fase IV. Gli organoidi renali mostrano strutture tubolari e sono facilmente osservabili in immagini in campo chiaro dopo 18 giorni di aggregazione. Sono state indotte cellule endoteliali CD31.

Il destrano è stato portato nei tubuli prossimali degli organoidi renali.