Prima di congelare a immersione le griglie di microscopia elettronica contenenti le cellule, ispezionare le griglie con un microscopio ottico invertito. Registrare la densità delle celle su ciascuna griglia per regolare i tempi di tamponamento durante il surgelazione. Scaldare due o tre millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS in una piastra vuota a 37 gradi Celsius.
Per la preparazione dei fiduciali d'oro, pipettare 50 microlitri di soluzione di perle d'oro colloidale a 10 nanometri in una provetta pulita da 1,5 millilitri. Aggiungere due microlitri di albumina sierica bovina e omogeneizzare ripetutamente mediante micropipettaggio. Centrifugare la provetta a 15.000-20.000 G per 15 minuti.
Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet utilizzando una micropipetta. Risospendere il pellet in 50 microlitri di PBS e centrifugare nuovamente la provetta, come dimostrato in precedenza. Aspirare quattro microlitri di pellet utilizzando una punta da 10 microlitri e trasferirlo in un tubo pulito da 1,5 millilitri.
Installare la camera ambientale al 95% di umidità e 30 gradi Celsius. Usando cinque per 15 pinzette, seleziona una griglia e lavala con PBS. Trasferire la griglia lavata su una pinzetta a immersione.
Una volta fissata la griglia, rimuovere le pinzette cinque per 15 e far scorrere il clamp sulle pinzette a immersione. Inserire la griglia nel congelatore a immersione mantenendo il clamp ben saldo. Aggiungi un microlitro di fiduciali d'oro sul retro della griglia.
Quindi aggiungi due o tre microlitri di PBS al lato carbonio della griglia. Utilizzare il blotting automatizzato per tamponare la parte posteriore della griglia prima del congelamento a immersione in etano liquido. Un'immagine al microscopio ottico ed elettronico criocorrelativa di cellule U2OS trasfettate ha rivelato la presenza di cellule produttrici di HIV.
Un'immagine di criotomografia elettronica ha mostrato più particelle di HIV che germogliano dalla membrana plasmatica delle cellule U2OS.
