Installare il set di perfusione nell'unità secondo il protocollo del produttore. All'interno di una cappa, collegare un chip fluidico vuoto e aggiungere un terreno SFM-34 integrato con citochine per riempire entrambi i serbatoi in condizioni sterili. Trasferire l'unità fluidica nell'incubatrice, collegandola alla pompa per la rimozione e la calibrazione delle bolle.
Rimuovere con cautela dall'incubatrice l'unità fluidica con il set collegato e trasferirla nella cappa insieme ai chip contenenti le celle. Clamp il tubo su entrambi i lati del chip di prova. Rimuovere il tubo clamped dal chip di prova e collegare il chip contenente le celle al tubo.
Dopo aver rimosso o aperto i morsetti, trasferire il sistema nell'incubatrice e collegare la pompa dell'aria all'unità fluidica. Rimuovere l'unità fluidica dalla pompa e spostarla nella cappa. Clamp il tubo su entrambi i lati del chip e rimuovere il tubo dai serbatoi sul chip.
Dopo aver rimosso delicatamente il terreno dal chip, lavare le celle con soluzione salina tamponata con fosfato o DPBS di Dulbecco. Aggiungere 150 microlitri di tampone di dissociazione e incubare per tre minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule sono staccate, raccogliere il tampone di dissociazione da un serbatoio e lavare il canale una volta con DPBS.
Lavare il serbatoio con il tampone di lavaggio per raccogliere le celle rimanenti dal chip. Infine, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio alle cellule raccolte prima di utilizzarne 10 microlitri per contare le cellule. Prima della stimolazione, le cellule mostravano un orientamento casuale, ma con la stimolazione si riorientavano parallelamente alla direzione del flusso.
Il profilo di espressione di CD34 delle cellule coltivate sotto flusso per cinque giorni e la percentuale di cellule CD34 positive recuperate dal canale fluidico, hanno mostrato l'efficacia del protocollo.
