Per iniziare, posizionare il dispositivo micro sim assemblato in fascette stringitubo sterili. Coltivare il dispositivo in una grande capsula di Petri sterile. Per una maggiore umidità, posizionare un coperchio per tubo conico da 50 millilitri riempito con acqua sterile.
Per preparare il dispositivo per la coltura cellulare, sciacquare la camera superiore con 100 microlitri d'acqua. Successivamente, preparare una soluzione di rivestimento mescolando collagene quattro, fibronectina bovina e acqua sterile. Rimuovere l'acqua dalla camera superiore e aggiungere 100 microlitri di soluzione di rivestimento.
Incubare la camera a 37 gradi Celsius per due o quattro ore. Dopo l'incubazione, sostituire la soluzione di rivestimento nella camera superiore con 100 microlitri di HECSR a temperatura ambiente. Aggiungere 20 microlitri di soluzione HECSR nella camera inferiore.
Per il passaggio, le cellule simili a EECM-BMEC, aggiungono una miscela di enzimi di distacco cellulare alle cellule e incubano a 37 gradi Celsius per cinque-otto minuti. Quindi, pipettare la sospensione cellulare e aggiungerla a quattro volte il volume del mezzo endoteliale in una provetta da centrifuga. Centrifugare a 200 G per cinque minuti e risospendere le cellule in un millilitro di HECSR.
Seminare le cellule a una densità di 40.000 cellule per centimetro quadrato nella camera superiore e incubare a 37 gradi Celsius per due o quattro ore per facilitare l'adesione cellulare. Dopo l'incubazione, sostituire il terreno con HECSR fresco in entrambe le camere. Fissare le celle aggiungendo 20 microlitri di metanolo al 100%, raffreddato a meno 20 gradi Celsius nella camera inferiore e 50 microlitri nella camera superiore.
Incubare il dispositivo a temperatura ambiente per 2-10 minuti. Successivamente, lavare le cellule aggiungendo 20 microlitri di PBS nella camera inferiore e 100 microlitri nella camera superiore. Dopo ogni lavaggio, verificare l'assenza di bolle nella camera inferiore.
Bloccare le cellule per 30 minuti aggiungendo 20 microlitri della soluzione bloccante nella camera inferiore e 50 microlitri nella camera superiore. Dopo il blocco, sostituire il volume nella camera superiore con 50 microlitri della soluzione anticorpale primaria e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con PBS, aggiungere 50 microlitri della soluzione anticorpale secondaria nella camera superiore e incubare per un'ora al riparo dalla luce.
Dopo il lavaggio con PBS, aggiungere 50 microlitri di Hoechst nella camera superiore e incubare per tre minuti. Quindi aggiungere 20 microlitri di PBS nella camera inferiore e 100 microlitri nella camera superiore. Visualizzare immediatamente il dispositivo su un microscopio confocale.
Individuare la finestra della membrana utilizzando un obiettivo 40x a lunga distanza di lavoro bagnato e passare ai canali di fluorescenza per controllare la colorazione di Hoechst e della giunzione. Qui vengono dimostrate le densità di posizionamento ottimali per la coltura cellulare HIPSC e il BPLC underseed. La co-coltura derivata da HIPSC è risultata più facile da distinguere nell'imaging a contrasto di fase rispetto alle co-colture primarie.
Una bassa semina BPLC si traduce in una scarsa copertura parassitaria e nella formazione di grumi, mentre l'eccesso di cibo porta al distacco dello strato parassitario dalla membrana. Nella co-coltura cellulare derivata da HIPSC immunocolorata, sono stati osservati due strati di cellule in stretta vicinanza, separati solo da una sottile nanomembrana di nitruro di silicio. Nel saggio di permeabilità, l'elevata variabilità nella permeabilità delle cellule endoteliali coltivate per due giorni indica che due giorni di coltura erano insufficienti per la maturazione della barriera.
Inoltre, non ci sono state differenze significative nella permeabilità tra i laboratori al momento della maturazione della barriera da quattro giorni in poi.
