Per iniziare, dopo aver acquisito il lungo RNA non codificante di interesse, incubare il tampone di ibridazione a 37 gradi Celsius per due ore. Successivamente, sciogliere le quattro sonde di densità ottica in 160 microlitri di acqua deionizzata trattata con dietilpirocarbonato lontano dalla luce. Preparare 200 microlitri della miscela della sonda per ogni pozzetto e impostare una serie di 50, 25, 12,5 e sei microgrammi per millilitro.
Denaturare la miscela della sonda a 73 gradi Celsius per cinque minuti. Prelevare una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti contenente 143 cellule B su vetrini di copertura sterili. Rimuovere il mezzo e lavare due volte per cinque minuti con PBS.
Disporre le cellule su uno shaker. Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 200 microlitri di etanolo al 100% in ogni pozzetto, fissando per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere l'etanolo, aggiungere 200 microlitri di Triton X-100 allo 0,1% in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere lo 0,1% di Triton X-100 e lavare due volte per cinque minuti con PBS. Quindi, rimuovere il PBS, aggiungere 200 microlitri di citrato salino di sodio o tampone SSC due volte in ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere due volte il tampone SSC, aggiungere 200 microlitri di etanolo al 70% in ciascun pozzetto e incubare per tre minuti a temperatura ambiente.
Scartare l'etanolo al 70%, quindi aggiungere 200 microlitri di etanolo all'85% in ogni pozzetto e incubare per tre minuti a temperatura ambiente. Successivamente, scartare l'etanolo all'85%, aggiungere 200 microlitri di etanolo al 100% in ciascun pozzetto e incubare per tre minuti a temperatura ambiente. Successivamente, assorbire e scartare l'etanolo al 100% e lasciare asciugare i pozzetti.
Successivamente, aggiungere 200 microlitri di miscela di sonde denaturate a ciascun pozzetto, quindi incubare a 37 gradi Celsius per una notte. Il giorno seguente, rimuovere i campioni da 37 gradi Celsius, scartare la miscela della sonda e aggiungere 200 microlitri di tampone preriscaldato 0,4 volte SSC 0,3%Tween 20 a ciascun pozzetto e lavare per due minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il buffer 0,4 volte SSC 0,3%Tween 20.
Aggiungere 200 microlitri di tampone SSC 0,1% Tween 20 a ciascun pozzetto e lavare per due minuti a temperatura ambiente. Eliminare quindi il buffer SSC 0,1% Tween 20 due volte. Aggiungere 200 microlitri di soluzione colorante DAPI e colorare per 20 minuti al buio su uno shaker.
Dopo la colorazione, scartare la soluzione DAPI e lavarla con PBS per due minuti a temperatura ambiente. Infine, aggiungere 50 microlitri di mezzo di montaggio contenente gomma al vetrino e posizionare il vetrino coprioggetto per fissare il vetrino. Vengono mostrate immagini rappresentative di SNHG6 FISH in cellule di osteosarcoma umano.
La sonda SNHG6 marcata con Cy3, che emette fluorescenza rossa, ha mostrato che SNHG6 è localizzato principalmente nel citoplasma. È stato osservato un colore di sfondo quando si utilizza un'alta concentrazione di sonda.
