Questo lavoro è supportato da sovvenzioni provenienti da (1) il National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); (2) la National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408); (3) Centro di innovazione collaborativa di Shanghai per la trasformazione industriale della preparazione alla MTC ospedaliera; (4) Progetti di ricerca nell'ambito del budget dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai (2021LK047).

Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli di tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. La Figura 1 mostra il protocollo generale per RNA FISH; La Tabella 1 contiene la composizione di tutte le soluzioni e la Tabella 2 contiene le sequenze di primer utilizzate in questo protocollo.
1. Preparazione della sonda
<ol><li>Identificare e acquisire la sequenza FASTA di un lncRNA target di interesse, ad esempio, da GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seguendo le indicazioni sul sito web, progettare le sonde ISH online19 e rivedere i suggerimenti dell'algoritmo di progettazione per elencare le sonde da ordinare con l'etichetta Cy3.</li>
	<li>Incubare il tampone di ibridazione a 37 °C per 2 ore di anticipo.</li>
	<li>Sciogliere 4 sonde di densità ottica (OD) in 160 μL di ddH2O trattato con dietilpirocarbonato (DEPC) alla concentrazione di 1 mg/mL al riparo dalla luce. NOTA: La densità ottica (OD) rappresenta l'unità di misura del DNA e dell'RNA. Di solito, 1 unità OD = 33 μg/mL di DNA.</li>
	<li>Preparare 200 μL della miscela di sonde per ciascun pozzetto (1,2 μL-10 μL di sonda, 70 μL di tampone di ibridazione, aumentare il volume con ddH2O trattato con DEPC fino a 200 μL) e impostare una serie di 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL e 6 μg/mL. NOTA: La concentrazione della sonda deve essere esplorata sperimentalmente in anticipo. Un'alta concentrazione della sonda porterà a un legame non specifico degli lncRNA, mentre una bassa concentrazione della sonda porterà a un rilevamento insensibile o fallito degli lncRNA.</li>
	<li>Denaturare la miscela della sonda a 73 °C per 5 min. NOTA: Se la sonda di DNA marcata con Cy3 è a doppio filamento, denaturare la sonda a DNA a singolo filamento a 95 °C per 5 minuti, quindi raffreddare rapidamente per 2 minuti su ghiaccio.</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule
<ol><li>Seminare 50.000 cellule 143B per pozzetto su vetrini coprioggetti sterili in una piastra di coltura cellulare da 12 pozzetti e incubarle per 24 ore (37 °C, 5% CO2) in DMEM. NOTA: Il numero specifico di cellule seminate qui varia con la dimensione della cella, che è appropriata per le cellule seminate per raggiungere una confluenza del 50% dopo essere state incubate per 24 ore. I vetrini coprioggetti sterili in vetro sono rotondi per essere adatti alla piastra a 12 pozzetti.</li>
	<li>Rimuovere il terreno e lavare per 2 x 5 minuti con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). NOTA: Preparare 1x PBS con ddH2O. PBS senza trattamento DEPC non può essere utilizzato perché contiene RNasi. Eseguire tutti i seguenti passaggi in condizioni di assenza di RNasi.</li>
	<li>Rimuovere 1x PBS e aggiungere 200 μL di etanolo al 100% in ciascun pozzetto per fissare per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere l'etanolo, aggiungere 200 μL di Triton X-100 allo 0,1% (in 1x PBS) in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Il tempo deve essere rigorosamente controllato con la permeabilizzazione Triton X-100 e non può essere troppo lungo.</li>
	<li>Rimuovere lo 0,1% di Triton X-100 e lavare 2 x 5 min con 1x PBS. NOTA: Se il protocollo deve essere sospeso qui, sostituire il PBS con etanolo al 70% (diluizione di etanolo al 100% con ddH2O privo di RNasi) e conservare il campione a 4 °C per un massimo di 3 mesi.</li>
	<li>Rimuovere 1x PBS, aggiungere 200 μL di 2x tampone di citrato salino di sodio (SSC) (diluizione di 20x SSC con ddH2O privo di RNasi) in ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti a 37 °C.</li>
	<li>Rimuovere 2 tamponi SSC, aggiungere 200 μL di etanolo al 70% in ciascun pozzetto e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare l'etanolo al 70%, aggiungere 200 μL di etanolo all'85% (diluizione di etanolo al 100% con ddH2O privo di RNasi) in ciascun pozzetto e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare l'etanolo all'85%, aggiungere 200 μL di etanolo al 100% in ciascun pozzetto e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Assorbire e scartare il 100% di etanolo; Lascia asciugare i pozzi.</li>
</ol>3. Ibridazione fluorescente in situ (FISH)
<ol><li>Aggiungere 200 μL di miscela di sonde (denaturata come al punto 1.5) in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per una notte (16-18 h). NOTA: Esiste una forte correlazione positiva tra la temperatura di ibridazione e la concentrazione della sonda; Pertanto, per ottimizzare lo sfondo, sia la temperatura di ibridazione che la concentrazione della sonda devono essere ridotte.</li>
	<li>Il giorno successivo, prelevare campioni a 37 °C ed eliminare la miscela della sonda. Aggiungere 200 μL di tampone 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a ciascun pozzetto (preriscaldato a 65 °C) e lavare per 2 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il tampone 0,4x SSC/0,3% Tween-20, aggiungere 200 μL di 2x SSC/0,1% Tween-20 buffer a ciascun pozzetto e lavare per 2 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere 2 tamponi SSC/0,1% Tween-20, aggiungere 200 μL di soluzione colorante 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1 μg/mL) e colorare per 20 minuti al riparo dalla luce.</li>
	<li>Scartare la soluzione colorante DAPI e lavare con 1x PBS per 2 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di terreno di montaggio contenente gomma sul vetrino e posizionare il vetrino coprioggetti sul vetrino da fissare. NOTA: Assicurarsi di posizionare il vetrino coprioggetto sul vetrino con il lato della cella rivolto verso il basso.</li>
	<li>Osservare al microscopio a fluorescenza. NOTA: Utilizzare un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale laser; Quest'ultimo produce una maggiore sensibilità e chiarezza dell'immagine.</li>
</ol>

FISH per la localizzazione di RNA lungo non codificante in cellule di osteosarcoma umano

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression.">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li><li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation,+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346.">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li><li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation,+migration,+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells.">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li><li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function.">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li><li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer.">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a/RASSF6+axis.">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li><li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K/AKT+pathway.">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ceRNA+in+cancer:+possible+functions+and+clinical+implications.">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li><li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells.">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy.">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a/b+and+miR-214+in+colorectal+cancer.">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 12 (1), 3 (2019).</li><li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p.">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li><li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p/ULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma.">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82 (2019).</li><li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li><li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids.">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells.">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li><li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples.">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).</li><li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+RNA+FISH+(smFISH)+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs.">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo RNA FISH non solo è in grado di rilevare la localizzazione degli lncRNA nelle cellule, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine nelle cellule, che possono essere utilizzati anche per rilevare la posizione degli lncRNA nei tessuti inclusi in paraffina. Tuttavia, il protocollo specifico in questi casi è diverso perché i tessuti inclusi in paraffina devono essere decerati21. Questa procedura sperimentale può essere applicata in piastre da 48 o 96 poz...

La nostra comprensione del genoma umano è stata notevolmente ampliata dai recenti progressi nella tecnologia dell'intero genoma. Circa il 93% del genoma umano può essere trascritto in RNA, ma solo il 2% degli RNA può essere tradotto in proteine; il restante 98% degli RNA che non hanno funzione di traduzione delle proteine sono chiamati RNA non codificanti (ncRNA)1. Come classe di RNA non codificanti (ncRNA), gli ncRNA lunghi (lncRNA), contenenti oltre 200 nucleotidi2, hanno attirato una crescente attenzione a causa del loro coinvolgimento in molti processi fisiologici e patologici delle cellule, come il differenziamento, il controllo del ciclo, l'apoptosi, la migrazione e l'invasione 3,4,5. Gli LncRNA svolgono il loro ruolo attraverso vari meccanismi, come la regolazione della struttura della cromatina e dell'espressione genica nucleare, il controllo del processo di splicing dell'mRNA e la modificazione post-trascrizionale6. Gli LncRNA regolano l'insorgenza, lo sviluppo e la metastasi delle neoplasie maligne sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale. La regolazione trascrizionale si realizza nel nucleo influenzando la trascrizione dell'RNA attraverso il legame alle strutture cromosomiche, mentre la regolazione post-trascrizionale si realizza nel citoplasma controllando i geni bersaglio tramite un meccanismo di RNA endogeno competitivo (ceRNA) 5,7,8. CeRNA ha rivelato un nuovo meccanismo di interazione con l'RNA, vale a dire che gli lncRNA possono agire come una spugna per adsorbire i miRNA e inibire la degradazione mediata dai miRNA dei geni bersaglio correlati9. Pertanto, le informazioni riguardanti la localizzazione subcellulare degli lncRNA, se uno specifico lncRNA si trova nel citoplasma o nel nucleo, sono importanti per aiutare a identificare le loro funzioni biologiche.
Attualmente, la localizzazione dell'lncRNA viene rilevata principalmente con due metodi, uno mediante il saggio di isolamento della frazione nucleo/citoplasma e l'altro mediante RNA FISH. Nel primo caso, gli RNA nella frazione citoplasmatica e nucleare vengono estratti rispettivamente, quindi l'amplificazione PCR viene eseguita con specifici primer di lncRNA per rilevare il rapporto tra lncRNA nel citoplasma e nel nucleo. Il vantaggio di questo metodo è l'efficienza temporale, mentre lo svantaggio è che l'effettiva localizzazione dell'lncRNA non si riflette direttamente nella proporzione relativa di lncRNA nel citoplasma e nel nucleo. RNA FISH è in grado di rilevare la localizzazione di lncRNA nelle cellule attraverso la progettazione di sequenze a catena antisenso specifiche per lncRNA seguite da marcatura con coloranti fluorescenti10. I metodi RNA FISH sono stati migliorati con i progressi nelle tecniche di sonde e nei metodi di rilevamento, tra cui i set di sonde oligo multiplemarcati con fluorofori 11, le sonde LNA 12 e le sonde a DNA ramificato (bDNA)13. RNA FISH è in grado non solo di rilevare la localizzazione di lncRNA, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine utilizzando l'immunofluorescenza bicolore o multicolore14.
In questo lavoro, abbiamo incluso come esempio il dettagliato protocollo di rilevamento della localizzazione intracellulare del gene ospite 6 dell'RNA piccolo nucleolare dell'RNA lncRNA (SNHG6) in cellule di osteosarcoma (143B) mediante RNA FISH. SNHG6 è un lncRNA di 600-730 nucleotidi nella sua forma matura e identificata come un nuovo oncogene in diversi tumori umani, tra cui il cancro del colon-retto, il cancro gastrico, il carcinoma ovarico a cellule chiare, l'osteosarcoma e il carcinoma epatocellulare15,16,17,18. Gli studi hanno confermato il coinvolgimento di SNHG6 nei comportamenti biologici delle cellule tumorali, come la proliferazione, l'EMT e l'autofagia, e hanno mostrato la localizzazione citoplasmatica di SNHG6 dove può influenzare i geni bersaglio legando (spugnando) i miRNA15,16,17. Questo protocollo di rilevamento dettagliato della localizzazione intracellulare di SNHG6 da parte di RNA FISH è presentato di seguito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>IC1000</td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate-12</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>3513,corning</td>
			<td>Place the coverslips in the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cell line (143B)</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td>osteosarcoma cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>&#160;430790, Corning</td>
			<td>Centrifuge the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>abs7026</td>
			<td>The cells are seeded on the coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 label-SNHG6 DNA probe</td>
			<td>Shanghai GenePharma Co.,Ltd</td>
			<td>A10005</td>
			<td>Detect SNHG6 location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>LM-E1141</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>DKT200-2&#160;</td>
			<td>Incubation at different high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%&#160;</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus</td>
			<td>Observation and positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td>
			<td>DHP-9051</td>
			<td>The samples were incubated at 37 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>E675004</td>
			<td>Attach the coverslips to the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>TS-8S</td>
			<td>Washing sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>188105</td>
			<td>The coverslips is placed on the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600198</td>
			<td>Permeable membrane and nuclear membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypsin (0.25%)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>25200056, Gibco</td>
			<td>trypsin treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600560</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna fluorescence in situ hybridization for long non-coding rna localization in human osteosarcoma cells

Sono stati studiati gli importanti ruoli degli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) nel cancro, come la regolazione della proliferazione, la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), la migrazione, l'infiltrazione e l'autofagia delle cellule tumorali. Il rilevamento della localizzazione degli lncRNA nelle cellule può fornire informazioni sulle loro funzioni. Progettando la sequenza della catena antisenso specifica per lncRNA seguita da marcatura con coloranti fluorescenti, è possibile applicare l'ibridazione in situ fluorescente dell'RNA (FISH) per rilevare la localizzazione cellulare degli lncRNA. Insieme allo sviluppo della microscopia, le tecniche RNA FISH ora consentono anche la visualizzazione degli lncRNA scarsamente espressi. Questo metodo non solo è in grado di rilevare la localizzazione dei soli lncRNA, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine utilizzando l'immunofluorescenza bicolore o multicolore. Qui, abbiamo incluso la procedura operativa sperimentale dettagliata e le precauzioni di RNA FISH utilizzando il gene ospite 6 (SNHG6) dell'RNA nucleolare piccolo lncRNA in cellule di osteosarcoma umano (143B) come esempio, per fornire un riferimento per i ricercatori che desiderano eseguire esperimenti di RNA FISH, in particolare lncRNA FISH.

Our understanding of the human genome has been greatly expanded by recent advances in whole-genome technology. About 93% of the human genome can be transcribed into RNAs, but only 2% of the RNAs can be translated into proteins; the remaining 98% of RNAs that have no protein translation function are called non-coding RNA (ncRNA)1. As a class of noncoding RNAs (ncRNAs), long ncRNAs (lncRNAs), containing over 200 nucleotides2, have attracted increasing attention due to their involvement in many physiological and pathological processes of the cells, such as differentiation, cycle control, apoptosis, migration, and invasion3,4,5. LncRNAs play their roles through various mechanisms, such as regulating chromatin structure and nuclear gene expression, controlling the mRNA splicing process, and posttranscriptional modification6. LncRNAs regulate the occurrence, development, and metastasis of malignancies at both the transcriptional and posttranscriptional levels. Transcriptional regulation is realized in the nucleus by affecting RNA transcription via binding to the chromosomal structures, while posttranscriptional regulation is realized in the cytoplasm by controlling the target genes via an endogenous competitive RNA (ceRNA) mechanism5, 7, 8. CeRNA has revealed a new mechanism of RNA interaction, namely that lncRNAs can act as a sponge to adsorb miRNAs and inhibit the miRNA-mediated degradation of related target genes9. Therefore, the information regarding the subcellular localization of lncRNAs, whether a specific lncRNA is located in the cytoplasm or nucleus, is important to help identify their biological functions.
At present, lncRNA localization is mainly detected by two methods, one is by nucleus/cytoplasm fraction isolation assay, and the other is by RNA FISH. In the former, RNAs in the cytoplasmic and the nuclear fractions are extracted respectively, and then PCR amplification is performed with specific lncRNA primers to detect the ratio of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. The advantage of this method is time efficiency, while the disadvantage is that the actual lncRNA localization is not directly reflected by the relative proportion of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. RNA FISH can detect lncRNA localization in cells through the design of lncRNA-specific antisense chain sequences followed by labeling with fluorescent dyes10. The RNA FISH methods have been improved with advances in probe techniques and detection methods, including fluorophore-labeled multiple oligo probe sets11, LNA probes12, and branched-DNA (bDNA) probes13. RNA FISH can not only detect the localization of lncRNA, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence14.
In this work, we have included the detailed intracellular localization detection protocol of lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in osteosarcoma cells (143B) by RNA FISH as an example. SNHG6 is a 600-730 nucleotide lncRNA in its mature spliced form and identified as a novel oncogene in diverse human cancers, including colorectal cancer, gastric cancer, ovarian clear cell carcinoma, osteosarcoma, and hepatocellular carcinoma15,16,17,18. Studies have confirmed the involvement of SNHG6 in biological behaviors of cancer cells, such as proliferation, EMT, and autophagy, and shown the cytoplasmic localization of SNHG6 where it may affect the target genes by binding (sponging) the miRNAs15,16,17. This detailed detection protocol of SNHG6 intracellular localization by RNA FISH is presented herein.

Autore in primo piano: RNA FISH per localizzare lncRNA-SNHG6 nelle cellule di osteosarcoma 

Ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA per la localizzazione di RNA non codificante lungo in cellule di osteosarcoma umano

The scope of our research is to provide a detailed RNA FISH protocol that's providing a reference for scientists who want to perform RNA FISH experiments. Our research has established that RNA FISH can be used to localize lncRNA in human osteosarcoma cells. Our protocol provided a comprehensive experimental procedure and the precautions for RNA FISH using lncRNA-SNHG6 in human osteosarcoma cells as a reference.

Sono mostrate immagini rappresentative di SNHG6 FISH in cellule di osteosarcoma umano (Figura 2). Il controllo negativo viene trattato con la sonda Ctrl negativa; il controllo positivo viene trattato con la sonda U6 20. La sonda SNHG6 e la sonda U6 sono etichettate con Cy3, che emette fluorescenza rossa. Il DAPI è un colorante che colora il DNA, che emette fluorescenza blu. Questo risultato mostra che SNHG6 è localizzato principalmente nel citoplasma e questa inform...

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Il presente protocollo descrive un metodo di ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA per localizzare gli lncRNA in cellule di osteosarcoma umano.

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

Lo scopo della nostra ricerca è quello di fornire un protocollo dettagliato RNA FISH che fornisca un riferimento per gli scienziati che desiderano eseguire esperimenti RNA FISH. La nostra ricerca ha stabilito che l'RNA FISH può essere utilizzato per localizzare lncRNA nelle cellule di osteosarcoma umano. Il nostro protocollo ha fornito una procedura sperimentale completa e le precauzioni per l'RNA FISH utilizzando lncRNA-SNHG6 in cellule di osteosarcoma umano come riferimento.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

1.0K Views.  Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Lo scopo della nostra ricerca è quello di fornire un protocollo dettagliato RNA FISH che fornisca un riferimento per gli scienziati che desiderano eseguire esperimenti RNA FISH. La nostra ricerca ha stabilito che l'RNA FISH può essere utilizzato per localizzare lncRNA nelle cellule di osteosarcoma umano. Il nostro protocollo ha fornito una procedura sperimentale completa e le precauzioni per l'RNA FISH utilizzando lncRNA-SNHG6 in cellule di osteosarcoma umano come riferimento.

Video: Autore in primo piano: RNA FISH per localizzare lncRNA-SNHG6 nelle cellule di osteosarcoma 

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), migration, infiltration, and autophagy of cancer cells. Localization detection of lncRNAs in cells can provide insight into their functions. By designing the lncRNA-specific antisense chain sequence followed by labeling with fluorescent dyes, RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be applied to detect the cellular localization of lncRNAs. Together with the development of microscopy, the RNA FISH techniques now even allow for visualization of the poorly expressed lncRNAs. This method can not only detect the localization of lncRNAs alone, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence. Here, we have included the detailed experimental operation procedure and precautions of RNA FISH by using lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in human osteosarcoma cells (143B) as an example, to provide a reference for researchers who want to perform RNA FISH experiments, especially lncRNA FISH.

The present protocol describes a method of RNA fluorescence in situ hybridization to localize the lncRNAs in human osteosarcoma cells.

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RNA Fluorescence In Situ Hybridization to Localize the lncRNAs in Human Osteosarcoma Cells

To begin, after acquiring the long non-coding RNA of interest, incubate the hybridization buffer at 37 degrees Celsius for two hours. Next, dissolve the four optical density probe in 160 microliters of diethyl pyrocarbonate treated deionized water away from the light. Prepare 200 microliters of the probe mixture for each well, and set up a series of 50, 25, 12.5, and six micrograms per milliliter.Denature the probe mix at 73 degrees Celsius for five minutes. Take a 12-well cell culture plate containing 143B cells on sterile glass cover slips. Remove the medium and wash twice for five minutes with PBS.Place the cells on a shaker. Then remove the PBS and add 200 microliters of 100%ethanol to each well, fixing for 15 minutes at room temperature. Then remove the ethanol, add 200 microliters of 0.1%Triton X-100 to each well, and incubate for 15 minutes at room temperature.Remove 0.1%Triton X-100 and wash two times for five minutes with PBS. Next, remove PBS, add 200 microliters of two times sodium-saline citrate or SSC buffer into each well, and incubate for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Remove two times SSC buffer, add 200 microliters of 70%ethanol into each well, and incubate for three minutes at room temperature.Discard the 70%ethanol, then add 200 microliters of 85%ethanol into each well and incubate for three minutes at room temperature. Next, discard the 85%ethanol, add 200 microliters of 100%ethanol to each well, and incubate for three minutes at room temperature. Afterward, absorb and discard the 100%ethanol and allow the wells to dry.Next, add 200 microliters of denatured probe mixture to each well, then incubate at 37 degrees Celsius overnight. The following day, remove samples from 37 degrees Celsius, discard the probe mixture, and add 200 microliters of preheated 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Remove the 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer.Add 200 microliters of two times SSC 0.1%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Next, discard the two times SSC 0.1%Tween 20 buffer. Add 200 microliters of DAPI staining solution and stain for 20 minutes in the dark on a shaker.After staining, discard the DAPI solution and wash it with PBS for two minutes at room temperature. Lastly, add 50 microliters of mounting medium containing gum to the slide and place the glass cover slip to fix the slide. Representative SNHG6 FISH images in human osteosarcoma cells are shown.SNHG6 probe labeled with Cy3, which emits red fluorescence, showed that SNHG6 is mainly localized in the cytoplasm. A background color was observed when using a high concentration of probe.