Analyzing Protein Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells by Western Blotting

Iniziare aggiungendo due millilitri di cellule MCF-7 contenenti diversi farmaci nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Incubare le colture cellulari per 24 ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 560 x g per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi lavare le celle due volte con PBS pre-raffreddato, centrifugando a 560 x g per tre minuti tra un lavaggio e l'altro. Aggiungere 50 microlitri di tampone di lisi alle cellule lavate e porre il campione in un bagno di ghiaccio per 15 minuti. Quindi centrifugare il campione a 8, 550 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il campione di proteina surnatante.

Combina il campione proteico con il tampone di carico in un rapporto di quattro a uno. Successivamente, denaturare la miscela a 100 gradi Celsius per 10 minuti in un bagno di metallo. Quindi raffreddare il composto a temperatura ambiente.

Separare il campione proteico utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide 10%SDS. Trasferire le proteine su una membrana in PVDF da 0,22 micrometri. Dopo aver bloccato la membrana con il 5% di BSA, incubarla con i corrispondenti anticorpi primari per una notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno seguente, incubare la membrana con l'anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi sviluppare le membrane utilizzando una soluzione di chemiluminescenza ECL e acquisire le immagini utilizzando un sistema di imaging Western blot quantitativo senza contatto. Il Western blot ha dimostrato che il trattamento con salidroside ha promosso l'espressione proteica dei fattori pro-apoptotici CC-9, CC-7, CC-3, Bim e Bax mentre ha inibito l'espressione proteica di BCL-2 anti-apoptotico.

Salidroside ha limitato in modo prominente i rapporti tra p-PI3K e PI3K e p-AKT e AKT. Nel frattempo, anche l'espressione proteica di mTOR, HIF-1 alfa e Fox01 è stata notevolmente soppressa.