Raccogliere le cellule MCF-7 mediante centrifugalizzazione a 560 G per tre minuti, a quattro gradi Celsius. Aggiungere 500 microlitri di RL-1 tamponato a cinque volte 10 alle sei cellule e mescolare accuratamente fino a quando non sono visibili masse cellulari. Successivamente, trasferire gli omogenati cellulari in una colonna di pulizia del DNA incorporata nella provetta di raccolta.
Centrifugare i campioni a 85-50-G per due minuti, a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere la colonna di pulizia del DNA, trattenendo il surnatante nella provetta di raccolta. Aggiungere 800 microlitri di tampone RL-2 e 500 microlitri di surnatante e mescolare delicatamente.
Successivamente, trasferire 700 microlitri della miscela in una colonna di solo RNA incorporata nella provetta di raccolta. Centrifugare la provetta a 8.550 g per un minuto, a quattro gradi Celsius. Quindi scartare il flusso nella provetta di raccolta.
Lavare la colonna di solo RNA prima con 500 millilitri di tampone RW-1 e poi con 700 millilitri di tampone RW-2, centrifugando per un minuto a 8.550 G e quattro gradi Celsius ad ogni lavaggio. Dopo aver rimosso l'RW-2 residuo mediante centrifugazione, trasferire la colonna di solo RNA in una nuova provetta di raccolta. Aggiungere 100 microlitri di acqua deionizzata priva di RNA, preriscaldata a 65 gradi Celsius al centro della membrana nella colonna di solo RNA, e attendere due minuti.
Quindi centrifugare a 8, 550-G per un minuto, a quattro gradi Celsius per raccogliere la soluzione di RNA. Impostare la miscela di reazione per la PCR e quindi impostare le condizioni di reazione PCR del sistema. Eseguire la procedura QRT PCR.
La PCR QRT ha mostrato che il trattamento con cilindricità ha promosso l'espressione genica dei fattori pro-apoptotici, CC-9, CC-7, CC-3, vim e vax, mentre ha inibito l'espressione genica di BCL-2 anti-apoptotico. Inoltre, la somministrazione di cilindricida ha ridotto i livelli di espressione genica di PI-3K, AKT, M-tor, HIF1-Alpha e Fox-01.
