Iniziare diluendo 0,5 microlitri di colture notturne di coltura di Agrobacterium tumefaciens con 50 millilitri di acqua ultrapura sterilizzata in autoclave. Distribuire 10 microlitri di questa coltura diluita su un brodo di lisogenia o su una piastra LB. Incubare la piastra a 28-30 gradi Celsius per uno o tre giorni.
Ora, inoculare una singola colonia in 20 millilitri di terreno LB integrato con rifampicina. Incubare la coltura per una notte a 28-30 gradi Celsius. Il giorno successivo, inoculare 500 millilitri di terreno LB semplice in un pallone agitatore con nove millilitri di coltura durante la notte.
Mettere le colture su uno shaker a 28-30 gradi Celsius. Dopo l'incubazione e la divisione delle colture in provette, centrifugare le provette refrigerate a quattro gradi Celsius e 4.000 G per 15 minuti. Utilizzando una pipetta, rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet in 50 millilitri di acqua ghiacciata.
Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante, risospendere il pellet in 25 millilitri di acqua ghiacciata in ogni provetta. Centrifugare come prima, quindi risospendere il pellet in un millilitro di glicerolo ghiacciato al 10%. Ora, unisci il contenuto di tutte le provette in un'unica provetta da 50 millilitri prima della centrifugazione.
Infine, dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 400 microlitri di glicerolo ghiacciato.
