Iniziare pipettando 0,5 millilitri di una coltura in fase logaritmica di clorella vulgaris. Distribuire la coltura su una piastra Tris-Acetato-Fosfato o TAP Agar. Coltiva la coltura per cinque giorni a 25 gradi Celsius.
Successivamente, inoculare 10 millilitri di brodo LB integrato con un anello pieno di coltura elettroporata di agrobacterium tumefaciens in un pallone shaker. Incubare il pallone a 28-30 gradi Celsius e 250 RPM per una notte. Il giorno successivo, inoculare un millilitro della coltura notturna in 50 millilitri di LB integrato. Incubare il pallone a 28-30 gradi Celsius e 250 RPM.
Co-coltivare le colture algali e batteriche. Per prima cosa, trasferisci la coltura di agrobatteri in una provetta da 50 millilitri. Centrifugare la provetta a 4.000 g per 30 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, pipettare il surnatante per scartarlo e lavare le cellule due volte usando il mezzo di induzione. Successivamente, aggiungere 25 millilitri di terreno di induzione sulla piastra di coltura di Chlorella Vulgaris. Trasferire le cellule in una provetta da 50 millilitri, quindi centrifugare a 4.000 G per 15 minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver smaltito il surnatante, unire il pellet di cellule algali con 200 microlitri di sospensione batterica. Agitare la coltura combinata in un'incubatrice rotante a 21-25 gradi Celsius, ad una temperatura di 150 giri/min per un'ora. Distribuire 200 microlitri di coltura mista su piastre di terreno di induzione, integrate con 15 millimoli di glucosio e incubare le piastre al buio a 21-25 gradi Celsius per tre giorni.
Dopo tre giorni, raccogliere le microalghe in un pallone utilizzando 10 millilitri di terreno TAP. Integrato con 20 milligrammi per litro di tetraciclina. Incubare il pallone al buio per due giorni, mantenendo una temperatura compresa tra 21 e 25 gradi Celsius.
Piastra 500 microlitri di coltura su terreni selettivi integrati con 20 milligrammi per litro di tetraciclina. Incubare le piastre a 21-25 gradi Celsius al buio per due giorni, prima di spostarle in una camera illuminata. Selezionare le singole colonie dalla piastra di trasformazione e striarle sulle piastre di agar TAP.
Per eseguire la PCR delle colonie, iniziare aggiungendo un piccolo volume di cellule algali trasformanti a 10 microlitri di acqua sterile. Far bollire la soluzione a 98 gradi Celsius per 15 minuti. Allo stesso modo, elaborare un altro modello PCR per la conferma dell'assenza di agrobatteri nel campione.
Eseguire i campioni di PCR su un gel di agarosio di DNA con una scala, per verificare le dimensioni dei frammenti risultanti. Le colonie trasformate sono state in grado di crescere su piastre contenenti igromicina con cefotaxima. Le colonie selvatiche non crescevano sulle placche.
Sono state ottenute colonie resistenti fino a 70 milligrammi per litro di cefotaxima. L'amplicone PCR di pCAMBIA1302 era assente nei campioni algali. Tuttavia, MGFP5G nell'amplicone è stato rilevato in tutti e tre i campioni di alghe.
Le colture algali che sono state ripetutamente sottocolture di Cefotaxima hanno mostrato l'assenza della proteina di virulenza E2, indicativa dell'assenza di plasmidi. È stata osservata una differenza significativa nella crescita delle alghe dei trasformanti e dei ceppi wild type. Nonostante una crescita inferiore, il trasformante aveva livelli di fluorescenza più elevati quando normalizzato per la densità cellulare.
