Per iniziare, usa le forbici per tagliare un piccolo pezzo di carta per lenti e metterlo in una capsula di Petri. Successivamente, versare la formalina contenente il cervello fisso e la colonna vertebrale isolati da un topo in un imbuto foderato con carta da filtro. Trasferisci il cervello e la colonna vertebrale in una capsula di Petri vuota.
Usa un bisturi per dividere il cervello in sei pezzi coronali. Usando una pinza, trasferisci i campioni di cervello su una metà della carta delle lenti nella capsula di Petri. Tagliare il midollo spinale in tre pezzi usando il bisturi, quindi tagliare il pezzo della colonna vertebrale sacrale all'estremità caudale fino a quando il midollo spinale non diventa visibile.
Raccogli la colonna vertebrale toracica con la mano non dominante. Prendi la pinza Adson con i denti ben chiusi nella mano dominante e spingi delicatamente l'estremità nell'apertura più piccola della colonna vertebrale con un leggero movimento di torsione. Quindi, usando una pinza, estrarre delicatamente il midollo spinale emergente dalla colonna, posizionare il pezzo del cordone nella capsula di Petri contenente la carta per lenti.
Usando un bisturi, dividi tre pezzi di midollo spinale in sezioni trasversali più piccole. Disponi questi pezzi sulla stessa metà della carta per lenti contenente i pezzi di cervello. Piega la carta per lenti per inserire i pezzi di fazzoletto e mettila in una cassetta etichettata.
Trasferire la cassetta in un barattolo contenente formalina. Dopo l'incubazione, trasferire la cassetta dal contenitore dei campioni nel primo bagno di formalina nel processatore automatico di tessuti e far funzionare il processatore per tutta la notte. Il giorno successivo, rimuovere le cassette dal processatore di tessuti e trasferirle nella camera di mantenimento calda della stazione di inclusione della paraffina, versare la cera di paraffina fino a coprire il fondo dello stampo.
Usando una pinza fine, posiziona i pezzi della sezione trasversale coronale e del midollo spinale del cervello nella paraffina sul fondo dello stampo. Trasferisci lo stampo sulla superficie di raffreddamento per alcuni secondi per fissare il cervello e i campioni in posizione. Riportare lo stampo sulla superficie riscaldata e riempirlo fino in cima con paraffina calda.
Posizionare il coperchio della cassetta etichettato con l'ID del campione sullo stampo. Versare la paraffina sopra il coperchio della cassetta. Trasferire lo stampo nella stazione di raffreddamento per consentire alla cera di solidificarsi.
Una volta che i blocchi sono completamente freddi, fissare il blocco su un microtomo rotante. Taglia i blocchi e taglia cinque sezioni micrometriche di ogni blocco di paraffina. Spostare il nastro di paraffina a bagnomaria a 42 gradi Celsius.
Raccogliere la sezione dal bagnomaria su un vetrino etichettato. Metti i vetrini in una griglia di plastica e cuoci le sezioni per una notte a 37 gradi Celsius in forno asciutto. Dopo la scansione, apri l'immagine J, quindi trascina e rilascia l'immagine tiff della sezione per l'analisi.
Osservare la sezione del midollo spinale in quattro quadranti e valutare la presenza di lesioni demielinizzanti in ciascun quadrante. Questa sezione ha un punteggio di quattro, perché ci sono lesioni in tutti e quattro i quadranti. Questa sezione assegna un punteggio uno, perché le lesioni sono solo in un quadrante.
La colorazione CD45 indica la presenza di leucociti nelle lesioni. Le nuove lesioni contengono molte cellule CD45 rispetto a quelle più vecchie. Al contrario, le nuove lesioni possono contenere meno assoni positivi per SMI-32 rispetto alle lesioni più vecchie.
I topi del gruppo wild type hanno sviluppato una grave EAE con paralisi completa. Mentre il gruppo OGR1-KO ha sviluppato una malattia lieve. Questa differenza nel punteggio clinico corrispondeva a variazioni nelle lesioni da demielinizzazione sub-meningea, nella percentuale di area mielinica colorata nel midollo spinale, inoltre, anche la percentuale di frazione mielinica differiva significativamente tra OGR1 e topi wild type ed era correlata con il punteggio EAE cumulativo.
Nell'EAE, l'infiammazione nel cervello è localizzata principalmente nel cervelletto e nel tronco encefalico. Ulteriori aree di infiammazione possono essere evidenti nel cervello, comprese le meningi, vicino ai ventricoli e in altre tracce di sostanza bianca come il nervo ottico e il corpo calloso. La luce del neurofilamento sierico misurata con un test di array di piccole molecole ha rilevato livelli di luce del neurofilamento sierico più elevati nei topi con EAE rispetto ai topi sani e questi livelli elevati sono correlati con la densità di SMI-32 positivo nel midollo spinale.
