Per iniziare, prendi un topo anestetizzato e applica una goccia di tropicamide all'1% e fenilefrina al 2,5% nell'occhio per dilatare la pupilla. Quindi applicare un gel oftalmico sulla cornea per prevenire la secchezza e la cataratta indotta dall'anestesia. Successivamente, installare un microscopio operativo verticale con un percorso di luce diretta in un ambiente sterile per eseguire l'iniezione sottoretinica.
Per preparare la siringa di vetro da 10 microlitri, staccare il mozzo dell'ago e collegare l'ago smussato calibro 33. Prendere il coperchio metallico del mozzo e fissare saldamente l'ago sulla siringa. Sciacquare l'ago con acqua distillata per testare la perdita e la pervietà dell'ago.
Quindi svuotare la siringa e metterla da parte con cura. Quindi, posizionare il topo anestetizzato su un cuscino e orientare l'occhio di trattamento verso l'obiettivo del microscopio. Applichi il cloridrato della proparacaina di 0,5% ed attenda 30 secondi.
Quindi applicare 150 microlitri di gel oftalmico sull'occhio e applicare un vetrino coprioggetto rotondo. Eseguire un esame oculistico preliminare osservando la cornea, l'iride, la pupilla, il cristallino e la congiuntiva. Regolare il piano focale per visualizzare il fondo oculare dell'occhio del topo attraverso la pupilla.
Quindi allineare la testa in modo che la testa ottica sia allineata con il centro della pupilla. Successivamente, picchiettare la base della provetta contenente i progenitori dei fotorecettori derivati da HESC per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Usando una siringa da microlitro di vetro da 10 microlitri con un ago smussato calibro 33, prelevare due microlitri di miscela cellulare.
Utilizzare un ago monouso calibro 30 per creare una ferita da sclerectomia posizionata due millimetri dietro il limbus. Mantenere l'angolo dell'ago a circa 45 gradi per evitare il contatto con la lente. Una volta che la punta dell'ago diventa visibile all'interno della cruna ritrarre con cautela l'ago.
Gettare l'ago usato in un contenitore appuntito per evitare lesioni da puntura d'ago. Ora prendi la siringa di vetro e inserisci l'ago smussato nella ferita della sclerectomia. Far avanzare l'ago smussato senza toccare il cristallino fino a raggiungere la retina opposta alla ferita d'ingresso.
Penetrare delicatamente nella retina fino a quando non si vede un ramo di pressione sulla sclera. Quindi iniettare due microlitri della sospensione cellulare o del terreno PRDM nello spazio sottoretinico mantenendo una leggera pressione sulla siringa. La formazione di una bolla visibile indica il successo dell'iniezione.
Attendi 10 secondi per consentire alle celle di stabilizzarsi. Ritrarre delicatamente l'ago dalla cruna di ritiro. Per visualizzare l'emissione, spostare la testa del mouse per posizionare l'occhio sotto il microscopio e fissare la posizione tenendo delicatamente la testa.
Per l'OCT intraoperatorio, utilizzare la funzione IOCT sul microscopio operatorio e selezionare il cubo sullo schermo OCT. Posizionare l'area di scansione sul bleb premendo i pulsanti freccia. Per regolare l'OCT, il centraggio dei vetrini e la messa a fuoco per ottenere la migliore qualità OCT, premere Capture o Scan per acquisire la scansione OCT dell'area BLB e rivedere le immagini per verificare la qualità delle scansioni.
Infine, rimuovere il vetrino coprioggetto e pulire delicatamente il gel dall'occhio utilizzando una garza. Somministrare unguento antibiotico una volta dopo l'iniezione per prevenire l'infezione. La scansione OCT ha rivelato entità HESC distinte sospese nell'occhio trattato con cellule.
Al contrario, l'occhio trattato con i media mostrava un fluido non offuscato, privo di cellule all'interno dello spazio sottoretinico.
