Ringraziamo Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee e Yingying Chung per aver fornito assistenza tecnica per la preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo la crioconservazione. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni del National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) e dalla National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) a H.G.T.

Gli esperimenti in vivo sono stati condotti in conformità con le linee guida e il protocollo approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) e dalla Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. I cuccioli sono stati immunodepressi da P17 (pre-trapianto) a P30 (post-trapianto) nutrendoli con acqua potabile contenente ciclosporina (260 g/L).
1. Preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo crioconservazione
<ol><li>Mezzo di differenziazione dei fotorecettori preriscaldati (PRDM) in un bagno d'acqua a 37 °C.</li>
	<li>Recupera dall'azoto liquido un crioviale contenente cellule progenitrici di fotorecettori derivate da hESC al giorno 32. Conservare con ghiaccio secco.</li>
	<li>Scongelare il crioviale a 37 °C a bagnomaria per 3-5 minuti. Risospendere il giorno 32 cellule in 1 mL di PRDM e centrifugare a 130 x g per 4 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di PRDM.</li>
	<li>Rimuovere 10 μL della miscela per il conteggio delle cellule. Mescolare le celle utilizzando lo 0,2% di blu di tripano secondo le istruzioni del produttore. Pipettare la miscela di cellule nel vetrino della camera di conteggio delle cellule. Determina il numero di celle e la vitalità tramite il contatore automatico delle cellule.</li>
	<li>Procedere al passaggio successivo quando la vitalità cellulare è superiore al 70%. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 130 x g per 4 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in PRDM alla concentrazione di 3 x 105 cellule/μL per il trapianto.</li>
	<li>Osservare la presenza di grumi cellulari visibili. Risospendere ripetutamente i grumi di cellule utilizzando un puntale di pipetta da 10 μL nella provetta per microfuge fino a quando non si osserva alcun grumo di cellule visibile. Caricare nella siringa per iniezione 33G per osservare l'estrusione della soluzione cellulare attraverso l'ago.</li>
</ol>2. Rilascio sottoretinico delle hESC nei topi rd10
<ol><li>Preparazione degli animali<ol><li>Anestetizzare il topo (P20, maschio/femmina, 3-6 g) utilizzando una combinazione di ketamina (20 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (2 mg/kg di peso corporeo) in una siringa di tubercolina da 1 mL collegata a un ago da 27G mediante approccio intraperitoneale. Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg/kg) al topo come analgesico preventivo.</li>
		<li>Dopo aver somministrato l'anestesia, instillare una goccia ciascuna di tropicamide all'1% e fenilefrina al 2,5% per la dilatazione della pupilla. Applicare un gel oftalmico sulla cornea per prevenire la secchezza dell'occhio e la cataratta correlata all'anestesia.</li>
		<li>Metti il topo in una gabbia vuota fino a quando non sarà completamente anestetizzato. Valutare il corretto livello di anestetico pizzicando il cuscinetto della zampa e verificare se l'animale non reagisce al forte pizzicotto.</li>
		<li>Quando il topo è completamente anestetizzato, posizionare l'animale su un tappetino caldo a 38 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilascio sottoretinico delle cellule<ol><li>Per utilizzare un approccio pars plana transvitreale a 1 porta, come fatto qui, eseguire l'iniezione sottoretinica in un ambiente sterile. Utilizzare un microscopio operativo verticale con un percorso di luce diretto per eseguire l'iniezione.</li>
		<li>Preparare la siringa di vetro da 10 μL rimuovendo il mozzo dell'ago. Montare l'ago smussato da 33G sulla siringa di vetro. Prenda il coperchio metallico del mozzo e fissi con cura l'ago sulla siringa.</li>
		<li>Sciacquare con acqua distillata per verificare la presenza di eventuali segni di perdite e pervietà dell'ago. Svuotare la siringa e metterla da parte con cura.</li>
		<li>Posizionare il topo anestetizzato su un cuscino, con l'occhio di trattamento rivolto verso l'alto verso l'obiettivo del microscopio. Applicare il cloridrato di proparacaina allo 0,5% e attendere 30 s. Applicare 150 μL di gel oftalmico sull'occhio e posizionare su di esso un vetrino coprioggetto rotondo.</li>
		<li>Eseguire un esame approssimativo dell'occhio osservando la cornea, l'iride, la pupilla, il cristallino e la congiuntiva. Attraverso la pupilla, visualizza il fondo oculare dell'occhio del topo regolando il piano focale. Regolare la testina fino a quando la testa ottica non è posizionata al centro della pupilla e ridurre al minimo il movimento della testa posizionandola correttamente sul cuscino.</li>
		<li>Picchiettare delicatamente la base del tubo con le hESC più volte per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Utilizzando la siringa da microlitri di vetro da 10 μL con un ago smussato da 33 G, prelevare 2 μL di cellule/terreni. Prelevare le cellule subito prima dell'iniezione per evitare l'assestamento/aggregazione delle cellule nella siringa.</li>
		<li>Utilizzando un ago monouso da 30 G, praticare una ferita da sclerectomia 2 mm dietro il limbus. Mantenere l'angolo dell'ago a ~45° per evitare di toccare l'obiettivo. Una volta visualizzata la punta dell'ago nell'occhio, ritirare delicatamente l'ago. Gettare l'ago nel contenitore appuntito dopo l'uso per evitare lesioni da puntura dell'ago.</li>
		<li>Prendere la siringa di vetro e inserire l'ago smussato nella ferita della sclerectomia. Senza toccare la lente, far avanzare l'ago smussato fino a raggiungere la retina opposta alla ferita d'ingresso. Assicurarsi che l'area di iniezione sia libera dai principali vasi sanguigni della retina per evitare sanguinamento.</li>
		<li>Penetrare delicatamente nella retina fino a quando non si vede un ramo di pressione sulla sclera. Tenere l'estremità smussata dell'ago parallela alla sclera per evitare la fuoriuscita delle cellule nello spazio vitreo.</li>
		<li>Iniettare lentamente 2 μL di sospensione cellulare o terreno PRDM (controllo) nello spazio sottoretinico mantenendo una leggera pressione sulla siringa. Con un'iniezione riuscita, nel sito di iniezione deve formarsi una bolla visibile (cioè retina sollevata con la sospensione/terreno cellulare al suo interno). NOTA: Durante l'iniezione deve essere esercitata solo una leggera pressione per evitare la lacerazione della retina e il blocco delle cellule sulla punta dell'ago.</li>
		<li>Dopo aver confermato la bolla, attendere 10 secondi per lasciare che le cellule si stabilizzino. Ritrarre delicatamente l'ago dalla cruna di ritiro.</li>
	</ol></li>
	<li>Tomografia a coerenza ottica (OCT) intraoperatoria del bleb (opzionale)<ol><li>Posiziona l'occhio del mouse per visualizzare il bollo sotto il microscopio muovendo lentamente la testa. Fissare la posizione tenendo delicatamente la testa. Non è necessaria alcuna dilatazione aggiuntiva della pupilla. Non rimuovere il vetrino coprioggetto e il gel sull'occhio. Fornisce un chiaro supporto ottico per visualizzare l'ebola.</li>
		<li>Eseguire l'OCT intraoperatorio utilizzando la funzione iOCT integrata del microscopio operatorio.</li>
		<li>Premere l'opzione Cubo nella schermata dello Strumento di personalizzazione di Office e posizionare l'area di scansione sul bleb premendo i pulsanti freccia . Regolare l'OCT facendo scorrere Centratura e Messa a fuoco per ottenere la migliore qualità OCT. Premere Acquisisci/Scansione per acquisire la scansione OCT dell'area bleb. Esaminare le immagini per verificare la qualità delle scansioni.</li>
	</ol></li>
	<li>Guarigione<ol><li>Rimuovere il vetrino coprioggetto e pulire il gel dall'occhio con una garza. Applicare un unguento antibiotico una volta dopo l'iniezione per prevenire l'infezione.</li>
		<li>Lasciare che l'animale si riprenda dall'anestesia sotto una luce calda fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere il decubito sternale e tornare alla gabbia di casa. Monitorare l'animale per almeno 3 giorni dopo l'iniezione per segni di infiammazione, infezione e angoscia. NOTA: La luce calda da 150 W deve trovarsi ad almeno 30 cm di distanza dalla gabbia dell'animale e prestare attenzione per evitare ustioni.</li>
		<li>Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 ore per 1 giorno o secondo le raccomandazioni del veterinario. Se si osserva un'infiammazione o un'infezione dell'occhio, consultare un veterinario per un trattamento appropriato.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulizia e sterilizzazione degli strumenti<ol><li>Sciacquare la siringa da microlitro di vetro da 10 μL e l'ago smussato da 33G con etanolo al 100% 10x. Lavare via l'etanolo facendo lampeggiare la siringa con acqua distillata.</li>
		<li>Smontare la siringa di vetro e l'ago. Asciugare la siringa per la conservazione.</li>
	</ol></li>
</ol>

Vista rivitalizzante: terapia con cellule staminali per la degenerazione retinica

Hwee Goon Tay è co-fondatore di Alder Therapeutics AB. Altri autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

L'iniezione sottoretinica è stata utilizzata per il trapianto di sospensione cellulare per il trattamento di RPE e malattie retiniche 23,25,26,27,28,31,40. Questo approccio è molto essenziale negli studi sui roditori non solo per il trapianto di cellule e gli approcci di terapia genica, ma...

Le malattie ereditarie della retina e la degenerazione maculare legata all'età portano alla perdita di cellule fotorecettrici e alla cecità. Il fotorecettore retinico è lo strato del segmento esterno della retina composto da cellule specializzate responsabili della fototrasduzione (cioè la conversione della luce in segnali neuronali). Le cellule fotorecettrici dei coni e dei bastoncelli sono adiacenti allo strato pigmentato retinico (RPE)1. La terapia sostitutiva cellulare con fotorecettori per compensare la perdita cellulare è stato un approccio terapeutico emergente e in via di sviluppo. Le cellule staminali embrionali (ESCs)2,3,4, le cellule RPE derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) e le cellule progenitrici retiniche (RPC)4,5,6,7,8 sono state utilizzate per ripristinare le cellule fotorecettrici danneggiate. Lo spazio sotto-retinico, uno spazio confinato tra la retina e l'RPE, è un luogo attraente per depositare queste cellule per sostituire le cellule fotorecettrici danneggiate, l'RPE e le cellule di Mueller a causa della sua vicinanza 9,10,11.
Le terapie geniche e cellulari hanno utilizzato lo spazio sottoretinico per la medicina rigenerativa per varie malattie della retina in studi preclinici. Ciò include la consegna di copie funzionali del gene o degli strumenti di editing genetico sotto forma di terapia oligonucleotidica antisenso12,13 o CRISPR/Cas9 o editing di base tramite la strategia basata su virus adeno-associati (AAV) 14,15,16, l'impianto di materiali (ad esempio, foglio RPE, protesi retiniche 17,18,19) e organoidi retinici derivati da cellule staminali differenziate 20,21,22 per il trattamento delle malattie retiniche e correlate all'RPE. Studi clinici che utilizzano hESC-RPE31 nello spazio sottoretinico per il trattamento dell'amaurosi congenita di Leber (LCA) associata a RPE6523,24, acromatopsia legata a CNGA325, retinite pigmentosa associata a MERTK26, coroideremia 27,28,29,30 si sono dimostrati efficaci. L'iniezione diretta di cellule in prossimità dell'area danneggiata migliora notevolmente la possibilità di insediamento cellulare nella regione appropriata, l'integrazione sinaptica e l'eventuale miglioramento visivo.
Anche se è stata stabilita l'iniezione sub-retinica in modelli umani e con occhi grandi (cioè maiale 32,33,34,35, coniglio 36,37,38,39,40 e primate non umano 41,42,43), tale iniezione nel modello murino è ancora impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare e dell'enorme lente che occupa l'occhio del topo 44,45,46. Tuttavia, i modelli geneticamente modificati sono prontamente disponibili solo in piccoli animali e non in animali di grandi dimensioni (ad esempio, conigli e primati non umani), pertanto l'iniezione sottoretinica nei topi attira l'attenzione per studiare nuovi approcci terapeutici nelle malattie genetiche retiniche. Per veicolare cellule o AAV nello spazio sottoretinico vengono utilizzati tre approcci principali, vale a dire la via transcorneale, la via trans-sclerale e la via pars plana (vedere la Figura 2). Le vie transcorneali e transsclerali sono associate alla formazione di cataratta, alle sinechie, al sanguinamento coroideale e al reflusso dal sito di iniezione 11,44,45,47,48,49. Abbiamo adottato l'approccio pars plana come visualizzazione diretta del processo di iniezione e il sito di iniezione può essere raggiunto in tempo reale al microscopio.
Recentemente abbiamo descritto un metodo in grado di differenziare le cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori fotorecettori in condizioni xenolibere, chimicamente definite, utilizzando l'isoforma di laminina ricombinante LN523 specifica per la retina umana. Poiché è stato scoperto che LN523 è presente nella retina, abbiamo ipotizzato che la nicchia della matrice extracellulare della retina umana potesse essere ricapitolata in vitro e quindi supportare la differenziazione dei fotorecettori dalle hESC36. L'analisi trascrittomica a singola cellula ha mostrato che i progenitori dei fotorecettori che co-esprimono l'omeobox cono-bastoncino e la recoverina sono stati generati dopo 32 giorni. Un modello murino mutante di degenerazione retinica 10 (rd10) che imita la retinite pigmentosa umana autosomica è stato utilizzato per valutare l'efficacia dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC al giorno 32 in vivo. Le cellule progenitrici dei fotorecettori derivate da hESC sono state iniettate nello spazio sub-retinico di topi rd10 a P20, dove la disfunzione e la degenerazione dei fotocettori sono in corso36. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC post-crioconservati e la consegna nello spazio sotto-retinico di topi rd10 . Questo metodo può essere utilizzato anche per somministrare AAV, sospensioni cellulari, peptidi o sostanze chimiche nello spazio sottoretinico nei topi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC &#160;0078-0813-01</td>
			<td>Tobrex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC 0078-0876-01</td>
			<td>Tobradex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proparacaine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0016-15</td>
			<td>0.5% Alcaine (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Tuberculin syringe</td>
			<td>Turemo</td>
			<td>SS01T2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Tropicamide</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0355-15</td>
			<td>1% Mydriacyl (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0342-05</td>
			<td>2.5% Mydfrin (5 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Disposable needle</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 G, 20 mm length blunt needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>Model: Eve</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without Vitamin A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587001</td>
			<td>2%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>Vetergesic vet (0.3 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKI-7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0742</td>
			<td>5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>260 g/L in drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Winner Industries Co. Ltd.</td>
			<td>1SNW475-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710&#8211;035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC cell line H1</td>
			<td>WiCell Research Institute</td>
			<td>WA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02-50</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Prospec-Tany Technogene</td>
			<td>CYT-272</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)</td>
			<td>Ceva Sant&#233; Animale</td>
			<td>KETALAB03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN-521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td>1 &#181;g36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre glass syringe (10 mL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2215</td>
			<td>10 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td>1%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140&#8211;050</td>
			<td>1x36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Media</td>
			<td>Satorius</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI LUMERA 700</td>
			<td>With Built-in iOCT function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>See media composition36. Basal Medium, 10 &#181;M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 &#181;M Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360&#8211;070</td>
			<td>1 mM36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rd10 mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>B6.CXB1-Pde6brd10/J mice</td>
			<td>Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0695/50</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip (12 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel (10 g)</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)</td>
			<td>Troy Laboratories</td>
			<td>LI0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985&#8211;023</td>
			<td>0.1 mM36</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sub-retinal delivery of human embryonic stem cell derived photoreceptor progenitors in rd10 mice

La rigenerazione di cellule fotorecettrici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane è una terapia promettente per il trattamento di malattie retiniche ereditarie e di invecchiamento in fase avanzata. Abbiamo dimostrato che la matrice isoforme di laminina retina-specifica ricombinante umana è in grado di supportare la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori dei fotorecettori. Inoltre, l'iniezione sottoretinica di queste cellule ha anche mostrato un ripristino parziale nei modelli di roditore e coniglio rd10 . L'iniezione sottoretinica è nota per essere un metodo consolidato che è stato utilizzato per fornire composti farmaceutici alle cellule fotorecettrici e allo strato epiteliale pigmentato retinico (RPE) dell'occhio a causa della sua vicinanza allo spazio bersaglio. È stato anche utilizzato per fornire vettori virali adeno-associati nello spazio sottoretinico per trattare le malattie della retina. La somministrazione sottoretinica di composti farmaceutici e cellule nel modello murino è impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare murino. Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC per l'iniezione e la tecnica di somministrazione sottoretinica di queste cellule in topi mutanti genetici di retinite pigmentosa, rd10. Questo approccio consente la terapia cellulare nell'area bersaglio, in particolare lo strato nucleare esterno della retina, dove si verificano malattie che portano alla degenerazione dei fotorecettori.

Inherited retinal diseases and age-related macular degeneration lead to photoreceptor cell loss and eventual blindness. The retinal photoreceptor is the outer segment layer of the retina comprised of specialized cells responsible for phototransduction (i.e., conversion of light to neuronal signals). The rod and cone photoreceptor cells are adjacent to the retinal pigmented layer (RPE)1. Photoreceptor cell replacement therapy to compensate the cell loss has been an emerging and developing therapeutic approach. Embryonic stem cells (ESCs)2,3,4, induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived RPE cells, and retinal progenitor cells (RPCs)4,5,6,7,8 were used to restore the damaged photoreceptor cells. Sub-retinal space, a confined space between the retina and the RPE, is an attractive location to deposit these cells to replace damaged photoreceptor cells, RPE, and Mueller cells due to its vicinity9,10,11.
Gene and cell therapies have been utilizing the sub-retinal space for regenerative medicine for various retinal diseases in pre-clinical studies. This includes the delivery of functional copies of the gene or gene editing tools in the form of either anti-sense oligonucleotide therapy12,13 or CRISPR/Cas9 or base editing via adeno-associated virus (AAV) based strategy14,15,16, implantation of materials (e.g., RPE sheet, retinal prosthetics17,18,19) and differentiated stem cell-derived retinal organoids20,21,22 to treat retinal and RPE-related diseases. Clinical trials using hESC-RPE31 in the sub-retinal space to treat RPE65-associated Leber congenital amaurosis (LCA)23,24, CNGA3-linked achromatopsia25, MERTK-associated retinitis pigmentosa26, choroideremia27,28,29,30 have been proven to be an effective approach. Direct injection of cells to the vicinity of the damaged area greatly improves the chance of cell settlement at the appropriate region, synaptic integration, and eventual visual improvement.
Even though sub-retinal injection in human and large-eyed models (i.e., pig32,33,34,35, rabbit36,37,38,39,40, and non-human primate41,42,43) has been&#160;established, such injection in the murine model is still challenging due to the constrain of the eyeball size and enormous lens occupying the mouse eye44,45,46. However, genetically modified models are only readily available in small animals and not in large animals (i.e., rabbits and non-human primates), therefore sub-retinal injection in mice draws attention to investigate novel therapeutic approaches in retinal genetic disorders. Three major approaches are being used to deliver cells or AAVs into the sub-retinal space, namely the trans-corneal route, trans-scleral route, and the pars plana route (See Figure 2). Trans-corneal and trans-scleral routes are associated with cataract formation, synechiae, choroidal bleeding, and reflux from the injection site11,44,45,47,48,49. We adopted the pars plana approach as a direct visualization of the injection process, and the injection site can be achieved in real-time under the microscope.
We recently described a method that can differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into photoreceptor progenitors under xenofree, chemically defined conditions using recombinant human retina-specific laminin isoform LN523. Since LN523 was found to be present in the retina, we hypothesized that the extracellular matrix niche of the human retina could be recapitulated in vitro and thereby support photoreceptor differentiation from the hESCs36. Single-cell transcriptomic analysis showed that photoreceptor progenitors co-expressing cone-rod homeobox and recoverin were generated after 32 days. A retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse model that mimics autosomal human retinitis pigmentosa was used to evaluate the efficacy of the day 32 hESC-derived photoreceptor progenitors in-vivo. The hESC-derived photoreceptor progenitor cells were injected into the sub-retinal space of rd10 mice at P20, where photoceptor dysfunction and degeneration are ongoing36. Here, we describe a detailed protocol for the preparation of the post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitors and delivery into the sub-retinal space of rd10 mice. This method can also be used to administer AAVs, cell suspensions, peptides, or chemicals into the sub-retinal space in mice.

Autore in primo piano: Miglioramento del ripristino della vista - Terapia basata su cellule staminali per le malattie della retina 

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

My research focuses on the development of stem cell based therapy for advanced stages of retinal diseases that cause photoreceptor degeneration. The goal of our research is to replace the loss of photoreceptors in patients with clinically safe and functional photoreceptor progenitors with the aim of improving their visual acuity or even restoring their vision. The main preclinical model is mice, but their small sized eyeball make it challenging to inject materials, especially under the retina.Developing the skill to perform successful subretinal injections requires patience and perseverance. We have successfully developed a laminin base for the receptor differentiation method that is able to generate photoreceptor progenitors in 32 days. The subretinal transplantations of this photoreceptor progenitors cell suspensions in the rodents resulted in synaptic connectivity between the holes and graft in the eyes.This has led to partial visual restoration. Our approach is simple, the right visualization helps the surgeon handle the needle to the area of interest.

La siringa di vetro da 10 μL è stata assemblata secondo le istruzioni del produttore (Figura 1) e l'ago smussato utilizzato per erogare la sospensione/il terreno cellulare è mostrato nella Figura 1B. I diversi approcci per l'iniezione sottoretinica sono illustrati nella Figura 2. Descriviamo l'approccio pars plana in questo protocollo (Figura 2C). L'ago smussato montato su una siringa di vetro è sta...

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Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

La mia ricerca si concentra sullo sviluppo di una terapia basata sulle cellule staminali per gli stadi avanzati delle malattie retiniche che causano la degenerazione dei fotorecettori. L'obiettivo della nostra ricerca è quello di sostituire la perdita di fotorecettori nei pazienti con progenitori fotorecettori clinicamente sicuri e funzionali con l'obiettivo di migliorare la loro acuità visiva o addirittura ripristinare la loro vista. Il principale modello preclinico sono i topi, ma il loro bulbo oculare di piccole dimensioni rende difficile l'iniezione di materiali, specialmente sotto la retina.Sviluppare l'abilità di eseguire iniezioni sottoretiniche di successo richiede pazienza e perseveranza. Abbiamo sviluppato con successo una base di laminina per il metodo di differenziazione dei recettori che è in grado di generare progenitori fotorecettori in 32 giorni. I trapianti sottoretinici di sospensioni cellulari progenitrici di questo fotorecettore nei roditori hanno provocato la connettività sinaptica tra i fori e l'innesto negli occhi.Questo ha portato a un parziale restauro visivo. Il nostro approccio è semplice, la giusta visualizzazione aiuta il chirurgo a gestire l'ago nell'area di interesse.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

668 Views.  Singapore Eye Research Institute. La mia ricerca si concentra sullo sviluppo di una terapia basata sulle cellule staminali per gli stadi avanzati delle malattie retiniche che causano la degenerazione dei fotorecettori. L'obiettivo della nostra ricerca è quello di sostituire la perdita di fotorecettori nei pazienti con progenitori fotorecettori clinicamente sicuri e funzionali con l'obiettivo di migliorare la loro acuità visiva o addirittura ripristinare la loro vista. Il principale modello preclinico sono i topi, ma il loro...

Video: Autore in primo piano: Miglioramento del ripristino della vista - Terapia basata su cellule staminali per le malattie della retina 

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Ricerca

Medicina

Reviving the Cryopreserved Day 32 hESC-Derived Photoreceptor Progenitors

Begin by placing PRDM in a water bath set at 37 degrees Celsius. Remove a cryovial containing day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells from liquid nitrogen, and keep it on dry ice. Then thaw the cryovial in a water bath at 37 degrees Celsius for three to five minutes.Re-suspend the cells in one milliliter of PRDM. Centrifuge them at 130G for four minutes After removing the supernatant, re-suspend the pellet in one milliliter of PRDM. To count the cells, take 10 microliters of the cell suspension and mix with 0.2%trypan blue, following the manufacturer's instructions.Pipette the cell mixture into the cell counting chamber slide, and determine the cell number and viability using an automated cell counter. If cell viability is above 70%centrifuge the remaining cell suspension at 130G for four minutes. Remove the supernatant and re-suspend the cell pellet in PRDM for transplantation.Using a 10 microliter pipette tip, re-suspend cell clumps in the microfuge tube until no clumps are visible. Load the suspension into a 33-gauge injection syringe and confirm the extrusion of cell solution through the needle.

Ravvivare i progenitori dei fotorecettori derivati da hESC crioconservati al giorno 32

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in rd10 Mice

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in  rd10  Mice  

To begin, take an anesthetized mouse and apply one drop of 1%tropicamide and 2.5%phenylephrine into the eye to dilate the pupil. Then apply an ophthalmic gel to the cornea to prevent dryness and anesthesia induced cataracts. Next, set up an upright operating microscope with a direct light path in a sterile environment to perform the subretinal injection.To prepare the 10 microliter glass syringe, detach the needle hub and attach the 33 gauge blunt needle. Take the metal hub cover and securely fasten the needle onto the syringe. Flush the needle with distilled water to test leakage and needle patency.Then empty the syringe and set it aside carefully. Next, position the anesthetized mouse on a cushion and orient the treatment eye toward the microscope's objective. Apply 0.5%proparacaine hydrochloride and wait for 30 seconds.Then apply 150 microliters of ophthalmic gel to the eye and affix a round cover slip. Perform a preliminary eye examination observing the cornea, iris, pupil, lens, and conjunctiva. Adjust the focal plane to visualize the fundus of the mouse eye through the pupil.Then align the head so that the optic head aligns with the center of the pupil. Afterwards, tap the base of the tube containing HESC derived photoreceptor progenitors to get a uniform cell suspension. Using a 10 microliter glass microliter syringe with a 33 gauge blunt needle, draw two microliters of cell mixture.Use a 30 gauge disposable needle to create a sclerectomy wound positioned two millimeters behind the limbus. Maintain the needle's angle at approximately 45 degrees to prevent contact with the lens. Once the needle tip becomes visible within the eye, carefully retract the needle.Discard the used needle into a sharp bin to prevent needle prick injuries. Now take the glass syringe and insert the blunt needle into the sclerectomy wound. Advance the blunt needle without touching the lens until it reaches the opposite retina of the entry wound.Gently penetrate the retina until a pressure branch on the sclera is seen. Then inject two microliters of the cell suspension or PRDM media into the subretinal space while maintaining gentle pressure on the syringe. The formation of a visible bleb indicates successful injection.Wait 10 seconds to allow the cells to settle down. Gently retract the needle from the eye. To visualize the bleb, move the mouse head to position the eye under the microscope and secure the position by gently holding the head.For intraoperative OCT, use the IOCT function on the operating microscope and select cube on the OCT screen. Position the scanning area on the bleb by pressing the arrow buttons. To adjust the OCT, slide centering and focus for the best OCT quality, press capture or scan to acquire the OCT scan of the bleb area and review the images to check the quality of the scans.Finally, remove the cover slip and gently clean the gel from the eye using gauze. Administer antibiotic ointment once after the injection to prevent infection. The OCT scan revealed distinct HESC entities suspended in the cell treated eye.In contrast, the media treated eye displayed unclouded fluid, void of cells within the subretinal space.