In Vitro Blood-Brain Barrier Model Assembly for Measurement of TEER

Per iniziare, sciacquare la camera superiore delle piastre a 24 pozzetti con PBS. Mescolare le celle BEND3 con il mezzo DMEM utilizzando un miscelatore a vortice per creare una sospensione. Quindi, seminare 200 microlitri di sospensione cellulare BEND3 sulla membrana PET nella camera superiore di una piastra a 24 pozzetti.

Aggiungere 1.200 microlitri di terreno completo alla camera inferiore della piastra per stabilizzare la pressione osmotica delle camere superiore e inferiore. Sostituire il mezzo rimuovendo lentamente il vecchio terreno da un lato con una pipetta a pressione negativa e aggiungendo un nuovo terreno lungo la parete durante lo scambio del fluido. Prima di misurare il TEER, posizionare il resistore, la soluzione di ipoclorito di sodio al 5%, l'etanolo al 75% e l'acqua bidistillata su un tavolo ultra pulito.

Accendere l'irradiazione UV per 30 minuti per eliminare batteri e agenti patogeni residui. Immergere gli elettrodi in una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% agitando lentamente per tre-cinque secondi. Quindi immergere in etanolo al 75% per 15 minuti.

Infine, trasferire in PBS o acqua bidistillata fino all'utilizzo. Quindi, accendi l'interruttore sul retro del misuratore di resistenze di cella. Fare clic su Seleziona piastra e selezionare piastra a 24 pozzetti.

A seconda dell'operazione, selezionare la sequenza di rilevamento appropriata. Inserire una resistenza da kilo ohm nella spina destra per calibrare lo strumento. Se il risultato della calibrazione è 1000 più meno 5 ohm, considerare lo strumento accurato.

In caso contrario, fare clic su Mode Units (Unità modali) nell'interfaccia principale per selezionare Ohm (Ohm), quindi fare clic su Calibrate (Calibrate). Quindi, rimuovere la resistenza kilo ohm e sostituirla con l'elettrodo di misura utilizzando un filo di collegamento. Posizionare l'elettrodo verticalmente nella piastra a 24 pozzetti contenente solo il fluido e fare clic su Blank Handling (Gestione del pezzo grezzo) sullo strumento.

Il valore di fondo della resistenza della piastra senza celle posizionate dovrebbe essere di circa 134,4 ohm. Successivamente, inserire i due elettrodi nelle camere superiore e inferiore della piastra posizionata, in modo che lo strato cellulare si trovi tra di loro. Registrare il valore della resistenza premendo delicatamente il pedale.

Assicurarsi che l'elettrodo non tocchi le celle nella camera superiore e nella parte inferiore della camera inferiore. Ottenere i valori TEER moltiplicando i valori di resistenza elettrica per l'area inferiore della camera superiore, come mostrato nell'equazione. Disegna un grafico a linee del TEER in funzione del tempo in giorni.

Quando il valore di resistenza non aumenta con il tempo, le cellule hanno formato una barriera. I valori di resistenza tracciati in funzione del tempo per le celle BEND3 hanno mostrato che i valori di TEER delle cellule hanno iniziato a stabilizzarsi il quinto giorno.