Per iniziare, etichettare due nuovi tubi fax come tubi misti uno e due. Preparare la sospensione cellulare e anticorpale secondo la tabella riportata per l'analisi citofluorimetrica. Dopo aver incubato le provette per 30 minuti, lavare ciascuna provetta due volte con un millilitro di tampone colorante.
Centrifugare le provette vortesse a 200 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone colorante. Rivestire i pozzetti di una piastra da 48 pozzetti con 200-500 microlitri di FBS e conservare per un'ora.
Quindi pipettare da 200 a 500 microlitri di terreno MSC al 10% dopo aver rimosso l'FBS residuo. Per preparare i campioni per lo smistamento di singole cellule, pipettare un millilitro di FBS in due nuove provette fax. Arrotolare i tubi per creare uno strato uniforme dell'FBS sulla superficie interna del tubo.
Preparare la sospensione cellulare e anticorpale in provette miste uno e due, come da tabella, per l'esperimento di cernita. Quindi incubare le provette al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con tampone colorante, centrifugare le provette a 200 G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone colorante e incubare per 15 minuti in cinque microlitri di DAPI prima della cernita. Per impostare la matrice di compensazione, utilizzare i tubi di compensazione delle macchie singole. Fare clic su esperimento dalla barra degli strumenti nel software dello strumento.
Quindi fare clic su Impostazione compensazione, seguito da Crea controlli di compensazione. Quindi, fare clic sulla provetta non colorata, seguita dai parametri nella finestra di dialogo del citometro. Regolare le tensioni modificando i valori per ciascun parametro.
Fare clic su carica nella dashboard di acquisizione, quindi fare clic su Acquisisci. Trascinare il gate P-1 sulla popolazione di celle e applicarlo a tutti i controlli di compensazione per impostare la tensione e il gate negativo per ciascun parametro. A questo punto caricare singolarmente i singoli tubi di compensazione delle macchie.
Registrare i dati e salvarli. Seleziona l'esperimento corrente, fai clic con il pulsante destro del mouse su di esso e seleziona Calcola valori di compensazione, quindi collega e salva. Eseguire la provetta mista e registrare 10.000 celle.
Impostare i cancelli sulla popolazione di interesse da smistare con la corretta strategia di gating. Successivamente, caricare una piastra di raccolta nello strumento e impostare un numero di cellule target, compreso tra 2.500 e 5.000 cellule per pozzetto. Quindi selezionare la maschera di purezza per l'ordinamento a cella singola.
Raccogli le popolazioni di cellule ordinate in un dispositivo di raccolta, tenendole sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento di smistamento. Infine, spostare le piastre in un incubatore di anidride carbonica al 5% per mantenere le colture a 37 gradi Celsius. I grafici dei saggi di citometria a flusso multiparametrici non hanno mostrato alcuna espressione dell'isotipo FITC degli anticorpi FITC CD 90.
L'espressione positiva dei marcatori CD-90 e CD-73 e l'espressione negativa di CD-45 sono paragonabili a quelle dei loro controlli non colorati e FMO. I fenotipi immunologici hanno mostrato la distribuzione dei marcatori da uno dei primi passaggi con i marcatori raccomandati dall'ISCT e CD-44, determinando le popolazioni parentali come MSC. I capannoni di passaggio tardivo sono stati utilizzati per lo smistamento a cella singola di espressioni alti e deboli.
Le cellule post-ordinate raccolte nella piastra a 48 pozzetti hanno mostrato aderenza e proliferazione, come la loro popolazione parentale. Le cellule post-selezionate si differenziano in presenza di fattori di crescita adipogenici.
