Dopo aver sterilizzato in autoclave due piastre in silicone, in condizioni sterili, rimuovere le piastre dal sacchetto dell'autoclave e posizionarle in piastre da 150 millimetri. Aggiungere 400 microlitri di soluzione di fibronectina a ciascun pozzetto delle piastre di silicone. Successivamente, sospendere nuovamente le cellule stromali mesenchimali indotte positive alla sclerassi nel terreno MSC e contare le cellule vitali utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
Calcolare il volume di sospensione cellulare necessario per ottenere 1,25 volte 10 al quarto di cellule per centimetro quadrato. Rimuovere questo volume di mezzi estensibili MSC dal tubo conico da 15 millilitri e aggiungere il volume richiesto di sospensione di cellule stromali mesenchimali indotte positive per la sclerasse. Capovolgere il tubo per ottenere l'omogeneità della nuova sospensione cellulare.
Aggiungere 400 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di entrambe le piastre di silicone. Rimetti il coperchio sulle piastre da 150 millimetri e incuba le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Per la tensione uniassiale, sciacquare l'apparecchio di filatura con acqua bidistillata, seguita da etanolo al 70%.
Pulire l'apparecchio, posizionarlo nella cappa di coltura cellulare ed esporlo alla luce ultravioletta per 15 minuti. Quindi, posizionare una piastra nell'incubatrice come controllo statico. Posizionare la seconda piastra in silicone inserita nell'apparecchio di allungamento allineando le viti con i fori della piastra in silicone.
Quindi posizionare il coperchio sull'apparecchio. Collegare l'apparecchio con la piastra in silicone alloggiata alla sorgente elettronica e posizionarlo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Impostare il programma di allungamento ciclico al 4% di deformazione sinusoidale a 0,5 hertz per due ore al giorno.
Avviare l'allungamento premendo il pulsante di avvio. Durante il carico meccanico delle cellule stromali mesenchimali indotte da sclerassi positive, densità di semina eccessivamente elevate hanno portato a una contrazione cellulare prematura e alla morte cellulare precoce. Dopo diversi giorni di allungamento, è stato osservato un certo grado di organizzazione cellulare nel gruppo allungato di cellule stromali mesenchimali indotte positive alla sclerassi, rispetto all'organizzazione cellulare casuale nel gruppo statico.
La colorazione con falloidina dei filamenti actonici ha mostrato che le cellule sono cresciute perpendicolarmente alla direzione di allungamento, in contrasto con l'organizzazione casuale delle cellule osservata nelle placche statiche. L'analisi dell'espressione genica ha rivelato una significativa sovraregolazione dei geni tenogenici sia a tre che a sette giorni, rispetto ai soli IMSC al giorno zero. La deposizione di collagene nel terreno dopo sette giorni di allungamento era significativamente più alta nel gruppo allungato con cellule stromali mesenchimali indotte positive alla sclerassi rispetto a tutti gli altri gruppi.
