Per iniziare, coltivare le hiPSC in terreno di mantenimento IPSC su una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti rivestita con gel di matrice extracellulare a ridotto fattore di crescita. Quando le cellule raggiungono l'80-90% v, rimuovere il terreno dalla piastra e lavare le cellule una volta con DPBS. Quindi aggiungere da 700 a 800 microlitri di EDTA 0,48 millimolari e incubare per un minuto a temperatura ambiente.
Rimuovere la soluzione digestiva e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Quando le cellule vengono digerite in fogli, aggiungere due millilitri di terreno di mantenimento per terminare la digestione. Trasferire la sospensione cellulare su una piastra di fissaggio bassa a sei pozzetti.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e 60 RPM per formare corpi embrionali sferici o EB. Dopo 24 ore, utilizzando una pipetta passata, trasferire gli EB nella provetta da centrifuga e lasciarla sedimentare per 5-10 minuti prima di rimuovere il surnatante. Aggiungere il mezzo di differenziazione MSC alla provetta e trasferire gli EB in una lama a sei pozzetti con attacco basso con due millilitri di mezzo di differenziazione MSC.
Coltivare gli EB sullo shaker a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per sette giorni. L'ottavo giorno, trasferire gli EB nella provetta da centrifuga come dimostrato in precedenza. Una volta che gli EB sono sedimentati, rimuovere il surnatante dalla provetta.
Aggiungere il terreno di mantenimento MSC nella provetta e trasferire gli EB in una piastra a sei pozzetti rivestita in gel di matrice extracellulare a fattore di crescita ridotto con due millilitri di terreno di mantenimento MSC. Dopo l'adesione cellulare, cambiare il terreno fino a quando la coltura raggiunge il 90% di confluenza. Successivamente, trattare la coltura derivata da EB con una soluzione di dissociazione a 37 gradi Celsius.
Quando una parte delle cellule viene digerita in singole cellule, aggiungere due millilitri del mezzo di mantenimento MSC per terminare la digestione e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga. Lavare una volta le restanti cellule non digerite dai pozzetti con DPBS. E digerire di nuovo come dimostrato in precedenza.
Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 250 g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e seminare le cellule in una piastra di coltura rivestita di gelatina. Coltivare le cellule nel terreno di mantenimento MSC al 90% di confluenza con un regolare cambiamento del terreno.
Colture hiIPCs linee come dimostrato in precedenza. Quando le celle raggiungono il 50-60% di confluenza, rimuovere il mezzo di manutenzione IPSC dalla piastra. Aggiungere due millilitri di terreno di mantenimento MSC.
E coltura per 14 giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con cambio medio giornaliero. Per la maturazione delle MSC, trattare la coltura monostrato con una soluzione di dissociazione a 37 gradi Celsius. Quando una parte delle cellule viene digerita in singole cellule, aggiungere due millilitri del mezzo di mantenimento MSC nei pozzetti per terminare la digestione e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga.
Lavare le cellule rimanenti non digerite una volta con DPBS e digerirle come dimostrato in precedenza. Quindi centrifugare la sospensione cellulare come dimostrato in precedenza e seminare le cellule su un piatto di coltura rivestito di gelatina. Coltivare le cellule nel terreno di mantenimento MSC al 90% di confluenza con un regolare cambiamento del terreno.
Nel metodo di formazione EB, le colonie di hiIPCs hanno mostrato una morfologia compatta prima del differenziamento. Dopo la dissociazione, si sono formati EB sferici uniformi, che hanno attirato volume nel tempo. Successivamente, gli EB si sono trasformati in cellule monostrato aderenti raggiungendo il 90% di confluenza entro il giorno 18 e acquisendo una morfologia a forma di fuso dopo due passaggi.
Allo stesso modo, nel metodo monostrato, le cellule proliferavano formando cellule aderenti multistrato. Dopo essere state impacchettate più volte, le cellule sono maturate in MSC con una tipica forma a fuso e una colonia vorticosa. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che gli hiIPC erano positivi per CD90 e negativi per CD34, CD45, CD105 e CD73.
Dopo la differenziazione, gli hiIPC che guidano le MSC esprimevano CD90, CD73 e CD105, mentre rimanevano negativi per CD34 e CD45. Le MSC derivate da monostrato hanno mostrato una maggiore formazione di depositi di calcio rispetto al metodo EB. Tuttavia, non sono state osservate differenze significative nelle capacità di differenziazione adipogenica e condrogenica.
Le capacità di proliferazione di entrambi i metodi sono state mantenute per un massimo di 20 passaggi.
