Light Exposure Experiment to Activate BMP or Nodal Signaling in Zebrafish

Per iniziare, incubare gli embrioni di zebrafish iniettati a 28 gradi Celsius. Circa 1,5 HPF allo stadio da 4 a 16 cellule, rimuovono gli embrioni non fecondati e non sani. Per il test di fenotipizzazione, avvolgere la piastra di controllo non esposta con embrioni non iniettati e iniettati in un foglio di alluminio.

Posizionare la piastra rivestita in lamina sul ripiano inferiore e la piastra esposta sul ripiano superiore della scatola luminosa a 28 gradi Celsius. Dopo aver verificato che il coperchio del piatto sia in posizione, attivare la luce blu e chiudere lo sportello della scatola luminosa per evitare l'esposizione involontaria alla luce della stanza. Per il test di immunofluorescenza intorno a 1,5 HPF, avvolgere singolarmente le piastre esposte e non esposte in un foglio di alluminio mantenendo la capsula proxy non avvolta.

Metti tutti i piatti nella scatola luminosa a 28 gradi Celsius senza attivare il LED. Chiudere lo sportello della scatola luminosa per evitare l'esposizione involontaria alla luce della stanza. A circa cinque HPF, utilizzare un endoscopio di dissezione per valutare lo stadio di sviluppo degli embrioni proxy.

Rimuovere anche le stoviglie avvolte per garantire un'esposizione uniforme alla temperatura su tutte le stoviglie. Una volta che gli embrioni proxy raggiungono il 40% di epibola, scoprire il piatto esposto e posizionarlo sul ripiano superiore della scatola luminosa. Tenere il piatto non esposto coperto sul ripiano inferiore.

Attiva immediatamente la luce blu, chiudi la porta e imposta un timer per 20 minuti. Per prepararsi al fissaggio, eliminare quanta più luce possibile nella stanza. Poco prima del fissaggio, prelevare tubi contenenti il 4% di formaldeide da quattro gradi Celsius e posizionarli accanto alla scatola luminosa.

Dopo 20 minuti, apri lo sportello della scatola luminosa e rimuovi il piatto che non è stato esposto alla luce. Utilizzare una punta di pipetta di vetro fiammato per rimuovere gli embrioni sensibili alla luce dal piatto. Quindi, per immergere gli embrioni in formaldeide al 4%, immergere la punta della pipetta di vetro fiammato nella formaldeide e lasciare che gli embrioni affondino nel liquido.

Conservare gli embrioni fissi a quattro gradi Celsius durante la notte.