Il finanziamento per questo protocollo è stato fornito dal NICHD Intramural Program a KWR (ZIA HD009002-01). Ringraziamo Jeff Farrell e il suo laboratorio per il loro illuminante feedback, Will Anderson per l'eccellente supporto tecnico, Leanne Iannucci per aver sottoposto a stress test il protocollo e la misurazione dell'irraggiamento e la struttura NIH Shared Zebrafish per il loro duro lavoro nel mantenere il pesce zebra in salute.

Studiare lo sviluppo con la manipolazione della segnalazione optogenetica nel pesce zebra

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'iniezione di mRNA è l'attuale strategia per fornire bOpto-BMP/Nodal agli embrioni di zebrafish. Questo metodo presenta diversi inconvenienti. Innanzitutto, la quantità appropriata di mRNA varia da laboratorio a laboratorio. La quantità utilizzata dovrebbe essere sufficiente per attivare la segnalazione in modo robusto con l'esposizione alla luce, ma senza l'attivazione involontaria del buio. È una buona idea testare diverse quantità per trovare i livelli ottimali di mRNA e, una volta stabiliti, creare aliquote di una miscela master per introdurre in modo riproducibile la stessa quantità di mRNA. In secondo luogo, una distribuzione non uniforme dell'mRNA iniettato può portare a un'attivazione non uniforme della segnalazione. Si ritiene che l'iniezione nel centro della cellula (non nel tuorlo) promuova una distribuzione uniforme dell'mRNA. Infine, poiché l'mRNA iniettato si degrada nel tempo, questo approccio potrebbe non essere adatto per esperimenti su embrioni più anziani. In futuro, questi problemi potrebbero essere risolti da linee transgeniche di zebrafish che esprimono ubiquitariamente bOpto-BMP/Nodal con un promotore materno o inducibile da farmaci. Sebbene lavorare con pesci zebra adulti potenzialmente sensibili alla luce possa essere una sfida in questo contesto, sono stati sviluppati con successo i transgenicizebrafish 61,62 e Drosophila 22,34,35,63 che ospitano strumenti optogenetici.
Evitare la fotoattivazione involontaria è una sfida generale con gli strumenti optogenici. Per semplicità, trattare gli embrioni iniettati di età superiore a 1,5 hpf come sensibili alla luce. L'esposizione involontaria alla luce può spesso essere evitata semplicemente avvolgendo piatti o stoviglie con un foglio di alluminio. Tuttavia, per gli esperimenti che richiedono l'osservazione visiva di embrioni vivi di età superiore a 1,5 hpf, è possibile utilizzare sorgenti di luce rossa o coprire le sorgenti di luce bianca con carta da filtro gel economica che blocca le lunghezze d'onda di dimerizzazione di LOV (Tabella dei materiali).
La scatola luminosa qui descritta è progettata per applicazioni specifiche che richiedono un controllo preciso dei livelli di irradianza luminosa, della dinamica e delle lunghezze d'onda (Figura 2). Altri vantaggi di questa scatola luminosa includono un'esposizione uniforme alla luce, un riscaldamento involontario trascurabile del campione, un ampio spazio per più piastre a 6 pozzetti e sorgenti luminose di lunga durata e spettralmente ben caratterizzate. Tuttavia, possono essere preferibili diverse strategie di esposizione alla luce a seconda dell'applicazione di ricerca. Molti laboratori hanno sviluppato sistemi di esposizione alla luce uniforme più semplici ed economici con ingombri ridotti, tra cui il rivestimento degli incubatori con strisce LED, la sospensione di pannelli LED sui campioni o l'incorporazione di LED nei coperchi delle piastre di coltura 32,38,39,40,64,65,66. È importante sottolineare che la scatola luminosa utilizzata in questo protocollo non consente agli utenti di regolare in modo indipendente i singoli pozzetti (a differenza di Bugaj et al.52) o di fornire un controllo spaziale sull'esposizione alla luce. L'attivazione optogenetica spazialmente localizzata è stata dimostrata con bOpto-BMP38 e bOpto-Nodal39 utilizzando laser in SPIM o sistemi confocali, rispettivamente, ed è stata anche realizzata con molte altre strategie optogenetiche in una varietà di sistemi modello (discussi in Rogers e Müller12). Alcuni approcci hanno anche raggiunto la risoluzione spaziale subcellulare 29,30,31. Sebbene l'implementazione di sistemi di esposizione alla luce localizzati spazialmente sia al di fuori dell'ambito di questo protocollo, gli esperimenti di attivazione spaziale con bOpto-BMP/Nodal sono teoricamente possibili con apparecchiature specializzate come dispositivi digitali a microspecchi o approcci di mascheramento. I lettori sono incoraggiati a esplorare l'ampia letteratura sulle scatole luminose fai-da-te per esperimenti optogenici prima di impegnarsi in una strategia di esposizione alla luce (vedi ad esempio, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar e Khammash 53 e altri a https://www.optobase.org/materials/).
Le strategie optogenetiche molecolari offrono spesso un grado più elevato di controllo spazio-temporale sui processi biologici rispetto agli approcci storici come i mutanti, l'espressione genica ectopica, le proteine ricombinanti e i farmaci. I lettori interessati ai benefici degli approcci optogenici possono esplorare altri strumenti pubblicati disponibili nel pesce zebra e in altri organismi. Questi includono strumenti per manipolare ulteriori vie di segnalazione 32,65,67,68, regolare l'espressione genica 61,64,66,69,70,71, alterare la localizzazione delle proteine 31,72 e attivare l'apoptosi 62. Questi strumenti e molti altri sono comodamente catalogati su OptoBase, una risorsa web curata per gli approcci di optogenetica molecolare28. Per coloro che sono ispirati a creare nuovi strumenti optogenici, la risorsa presenta anche utili descrizioni di proteine sensibili alla luce che sono state impiegate in un'ampia gamma di strategie, comprese le proteine sensibili alla luce che rispondono alle lunghezze d'onda del verde, del rosso e del vicino infrarosso. Siamo entusiasti che la comunità scientifica si renda conto del pieno potenziale degli approcci optogenetici molecolari.

Le vie di segnalazione consentono alle cellule di rispondere al loro ambiente e coordinare le attività su scala tissutale e organismuale. I segnali cruciali per lo sviluppo embrionale includono la proteina morfogenetica ossea (BMP) dei membri della superfamiglia TGF-beta e il nodale 1,2,3. Durante l'embriogenesi, le vie regolate da questi e altri segnali modellano il piano corporeo controllando l'espressione genica e processi aggiuntivi per garantire che diversi tessuti e organi si sviluppino e si interfacciano correttamente. Le patologie, tra cui i difetti congeniti e il cancro, possono verificarsi quando la segnalazione o le risposte alla segnalazione sono perturbate 4,5,6,7. Nonostante le rigorose indagini sulla segnalazione, resta ancora molto da scoprire su come i livelli e le dinamiche vengono decodificati in una varietà di contesti 8,9,10,11, specialmente durante lo sviluppo12,13,14,15,16,17,18,19.
Per capire come viene decodificata la segnalazione, un esperimento ideale sarebbe quello di manipolare i livelli, i tempi e/o le dinamiche di segnalazione - con un alto grado di controllo spaziale e temporale - e valutare i risultati. Ad esempio, vengono proposti precisi gradienti di segnalazione spaziale per modellare i tessuti in via di sviluppo20,21. L'alterazione delle distribuzioni spaziali del gradiente di segnalazione aiuterebbe a verificare questa ipotesi22. Inoltre, l'importanza delle dinamiche di segnalazione nel generare diverse risposte cellulari sta diventando sempre più chiara: la stessa via di segnalazione può istruire le cellule a differenziarsi o proliferare a seconda della frequenza di segnalazione, ad esempio 9,23. I paradigmi sperimentali in cui le dinamiche di segnalazione possono essere facilmente manipolate saranno utili per esplorare la relazione tra dinamica e decisioni sul destino cellulare 8,12,13,14,15.
Storicamente, sono stati utilizzati diversi metodi per manipolare la segnalazione in contesti di sviluppo, portando a scoperte fondamentali 1,2,3. La segnalazione può essere bloccata utilizzando mutanti con perdita di funzione della via, espressione di inibitori ectopici o farmaci antagonisti. I metodi per attivare la segnalazione includono farmaci agonisti, ligandi ricombinanti, espressione ectopica di ligandi o recettori costitutivamente attivi e mutanti con perdita di funzione degli inibitori della via. Questi metodi spaziano lungo un continuum di controllo sperimentale. Ad esempio, i mutanti e l'espressione ectopica possono cadere sul lato del continuum: con questi approcci, cambiamenti drammatici e sistemici nell'attività del percorso possono causare morte prematura e precludere indagini in fasi successive, o nel tempo possono provocare effetti pleiotropici difficili da districare. Inoltre, è spesso difficile manipolare in modo indipendente una funzione di segnalazione alla volta, come il livello o la durata. Verso l'altra estremità del continuum, alcuni metodi offrono un controllo sperimentale più preciso, come i dispositivi microfluidici che espongono i campioni a farmaci o proteine ricombinanti con controllo temporale e talvolta spaziale 18,24,25, o metodi genetici, inclusi promotori inducibili da shock termico e tessuto-specifici che possono offrire benefici simili16,26,27. Tuttavia, questi metodi possono essere difficili da eseguire, potrebbero non essere reversibili, potrebbero avere una cinetica relativamente lenta o una scarsa risoluzione e potrebbero non essere disponibili in alcuni sistemi modello.
Gli approcci optogenetici molecolari sono una potente aggiunta a questo kit di strumenti. Questi approcci utilizzano proteine che rispondono a diverse lunghezze d'onda della luce per manipolare i processi biologici, tra cui la segnalazione 8,12,13,14,15, e sono stati sviluppati nel corso di decenni per l'uso in una varietà di sistemi, dalla coltura cellulare agli animali interi 12,13,28. Rispetto agli approcci storici, l'optogenetica molecolare può spesso offrire un grado più elevato di controllo spazio-temporale sui processi biologici: il controllore nei sistemi optogenetici è la luce e il controllo della lunghezza d'onda, dell'intensità, della durata e della frequenza di esposizione della luce è relativamente semplice. Con sistemi sofisticati come i microscopi confocali e a due fotoni, è possibile il controllo spaziale nella gamma subcellulare 29,30,31. Strumenti per manipolare optogeneticamente la segnalazione sono stati sviluppati e applicati in diversi sistemi, tra cui quelli descritti in Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 e Huang et al.34. Ad esempio, sfruttando il controllo spaziale offerto dall'optogenetica, questa strategia è stata recentemente utilizzata per modificare un gradiente di segnalazione negli embrioni di Drosophila, dimostrando che l'embriogenesi del moscerino è sorprendentemente robusta ai cambiamenti di questo gradiente22. La reversibilità e la rapida cinetica on/off degli attivatori di segnalazione optogenetica li hanno anche resi strumenti interessanti per studiare la decodifica delle dinamiche di segnalazione 8,12,13,14,15,34,35,36.
L'embrione precoce di zebrafish è un sistema in vivo adatto per gli studi optogenetici perché è fecondato esternamente, trasparente, adatto alla microscopia e geneticamente trattabile. L'esposizione alla luce è più facile da somministrare agli embrioni che si sviluppano al di fuori della madre, la luce può penetrare e accedere ai loro tessuti non opachi, gli embrioni vivi di zebrafish tollerano bene l'imaging (oltre ad essere trasparenti) e i metodi genetici esistenti offrono opportunità dirette per esperimenti di knockdown e sovraespressione, oltre allo sviluppo di utili transgenici37.
Recentemente, sono stati sviluppati strumenti optogenetici per attivare la segnalazione BMP38 e Nodal39 in embrioni di zebrafish con esposizione alla luce blu (Figura 1). Ci riferiamo a questi strumenti come bOpto-BMP e bOpto-Nodal (b per attivato dalla luce blu e Opto per optogenetico). bOpto-BMP/Nodal si basano su meccanismi di attivazione della via simili. Il legame dei ligandi BMP o nodali ai rispettivi recettori serina-treonina chinasi guida le interazioni del dominio recettoriale chinasico che portano alla fosforilazione degli effettori di segnalazione (Smad1/5/9 per BMP e Smad2/3 per Nodal). Gli effettori di segnalazione fosforilati traslocano quindi nel nucleo e regolano l'espressione genica bersaglio3 (Figura 1A,D). Queste interazioni recettoriale-chinasi possono essere rese sensibili alla luce accoppiando le recettori chinasi alle proteine dimerizzanti sensibili alla luce: con l'esposizione alla luce, queste proteine chimeriche dovrebbero dimerizzarsi, facendo sì che i domini recettoriali chinasici interagiscano e attivino la segnalazione (Figura 1B,C,E,F). È importante sottolineare che, a differenza dei recettori endogeni, bOpto-BMP/Nodal non contengono domini extracellulari leganti il ligando, garantendo un'attività indipendente dal ligando (Figura 1C,F). Questa strategia di attivazione optogenetica è stata inizialmente ottenuta con i recettori tirosin-chinasici40,41,42 e poi applicata ai recettori serina-treonina chinasi.
bOpto-BMP/Nodal utilizza il dominio LOV (Homodimerizing Light-Oxygen-Voltage Sensing) reattivo alla luce blu (~450 nm) dell'alga Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. Questi costrutti sono costituiti da un motivo di miristoilazione mirato alla membrana seguito da domini chinasici del recettore BMP o nodale, fusi in un dominio LOV (Figura 1B,E). L'esposizione alla luce blu dovrebbe causare l'omodimerizzazione di LOV, con conseguenti interazioni del dominio recettore-chinasico che portano alla rispettiva fosforilazione di Smad e all'attivazione della via (Figura 1C,F). Per bOpto-BMP, è stato riscontrato che una combinazione di costrutti con i domini chinasici del recettore di tipo I di Acvr1l (noto anche come Alk8) e BMPR1aa (noto anche come Alk3) e il dominio della chinasi del recettore di tipo II di BMPR2a attiva in modo ottimale la segnalazione38 (Addgene #207614, #207615 e #207616). Per bOpto-Nodal, viene utilizzata una combinazione di costrutti con il dominio chinasico del recettore di tipo I di Acvr1ba e il dominio della chinasi del recettore di tipo II di Acvr2ba39.
bOpto-BMP/Nodal sono stati introdotti in embrioni di zebrafish precoce iniettando mRNA allo stadio di una cellula e utilizzati per studiare il ruolo della durata della segnalazione nell'interpretazione nodale39, per determinare perché il pesce zebra perde la capacità di rispondere a Nodal45 e per esaminare come i geni bersaglio BMP rispondono a diversi livelli di segnalazione BMP38. È probabile che questi strumenti continueranno ad essere utili in una vasta gamma di indagini future. Tuttavia, il punto di forza degli attivatori di segnalazione optogenetica è anche la loro debolezza: i campioni sensibili alla luce devono essere trattati con cura per evitare l'attività di segnalazione ectopica involontaria. L'esposizione alla luce della stanza o alla luce solare può attivare bOpto-BMP/Nodal.
Questo protocollo fornisce suggerimenti pratici per l'utilizzo di attivatori BMP e nodali basati su LOV codificati con mRNA nei primi embrioni di zebrafish. Si inizia descrivendo in dettaglio una strategia per costruire una scatola luminosa per controllare l'esposizione alla luce e la temperatura uniformi (Figura 2, File supplementare 1, File supplementare 2, File supplementare 3, File supplementare 4, File supplementare 5, File supplementare 6, File supplementare 7, File supplementare 8). Descrive quindi due esperimenti di controllo chiave che determinano se un attivatore di segnalazione optogenetica si comporta come previsto, cioè attivando l'attività della via solo se esposto alla luce (Figura 3). Il primo test di controllo prevede l'esame dei fenotipi a un giorno dopo la fecondazione in embrioni esposti alla luce e non esposti (Figura 3A). Gli embrioni esposti alla luce iniettati con mRNA, ma non gli embrioni non esposti, dovrebbero fenocopiare la BMP o la sovraespressione linfonodale (Figura 4A,B; I fenotipi BMP, in particolare, sono chiaramente distinguibili in questo momento, punto46). Questo test fornisce una rapida lettura dell'attività. Nel secondo test di controllo, per determinare se i fenotipi sono causati specificamente da un eccesso di BMP o da una segnalazione linfonodale e per osservare direttamente il cambiamento nei livelli di segnalazione, la colorazione in immunofluorescenza viene utilizzata per rilevare gli effettori di segnalazione fosforilati (pSmad1/5/9 o pSmad2/3, rispettivamente) dopo un'esposizione alla luce di 20 minuti intorno alla fase tardiva della blastula/gastrulazione precoce, quando l'attività di segnalazione è stata ben descritta12, 16,17,47,48,49,50 (Figura 3B e Figura 4C). (Si noti che, sebbene sia stata dimostrata l'attivazione spazialmente localizzata sia per bOpto-BMP38 che per bOpto-Nodal39, questo protocollo descrive solo l'esposizione uniforme alla luce e le strategie di attivazione della segnalazione.) Si consiglia di eseguire questi esperimenti di controllo prima di applicare bOpto-BMP/Nodal a specifiche domande di ricerca al fine di determinare le condizioni sperimentali locali ideali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Building a light box &#38; Light exposure protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#8 x 1&#34; Hex Self-drilling Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>99663A222</td>
			<td>1.4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (142 liters)</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>139400</td>
			<td>1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Panel Mount (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Incubator_panel</td>
			<td>1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit</td>
			<td>CO-Z</td>
			<td>SDB0001TA</td>
			<td>1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32&#34; thick black silicone</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5812T12</td>
			<td>1.4.3 
			1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED microplate illuminator</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.1 
			1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 10mm Cube Standoff</td>
			<td>Newark Eletronics</td>
			<td>005.60.533</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A156</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A305</td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memory card thermometer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-081-111</td>
			<td>1.9 
			3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW)</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S170C</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red gel filter paper #E106</td>
			<td>Rosco / B&#38;H Foto &#38; Electronics</td>
			<td>110084014805-E106</td>
			<td>4.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Side Brackets (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Side_bracket</td>
			<td>1.4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Bracket (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Vertical_bracket</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2&#34; wd 1/4&#34; tk</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8694K12</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generating mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZNA MicroElute Cycle Pure Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6293-02</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-30-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-34-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R3189L</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207614</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk8</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207615</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-BMPR2a</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207616</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250 rxns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injecting mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (UltraPure)</td>
			<td>Invitrogen / Thermo Fisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml glass beakers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB100250</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dishes (case of 50)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08 772 1B</td>
			<td>3.1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-8A ball joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>B-8A</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back pressure unit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>BPU</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot switch (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>FWS</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GJ-1 magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish bottoms (for dechorionating)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>08-748A</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (5 3/4&#34; with wide tip)</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>3.1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection dish molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>tu1</td>
			<td>3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP iron plate</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IP</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-152 micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipette holder kit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MIMPH-MPIP-Kit</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometers</td>
			<td>Meiji Techno America</td>
			<td>MA285</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td>3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (10 ml, green)</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottles (500 ml)</td>
			<td>Nalgene / Thermo Scientific</td>
			<td>2402-0500</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic signaling activation in zebrafish embryos

Le vie di segnalazione orchestrano processi biologici fondamentali, tra cui lo sviluppo, la rigenerazione, l'omeostasi e la malattia. Sono necessari metodi per manipolare sperimentalmente la segnalazione per capire come la segnalazione viene interpretata in questi contesti di ampio respiro. Gli strumenti di optogenetica molecolare possono fornire manipolazioni reversibili e sintonizzabili dell'attività della via di segnalazione con un alto grado di controllo spazio-temporale e sono stati applicati in vitro, ex vivo e in vivo. Questi strumenti accoppiano domini proteici sensibili alla luce, come il dominio LOV (LOV) che omodimerizza la luce blu, con effettori di segnalazione per conferire un controllo sperimentale dipendente dalla luce sulla segnalazione. Questo protocollo fornisce linee guida pratiche per l'utilizzo della proteina morfogenetica ossea (BMP) basata su LOV e degli attivatori di segnalazione nodale bOpto-BMP e bOpto-Nodal nell'embrione precoce di zebrafish otticamente accessibile. Descrive due esperimenti di controllo: un test fenotipico rapido per determinare le condizioni sperimentali appropriate e un test di immunofluorescenza per valutare direttamente la segnalazione. Insieme, questi esperimenti di controllo possono aiutare a stabilire una pipeline per l'utilizzo di strumenti optogenetici nei primi embrioni di zebrafish. Queste strategie forniscono una potente piattaforma per studiare i ruoli della segnalazione nello sviluppo, nella salute e nella fisiologia.

Signaling pathways allow cells to respond to their environment and coordinate activities at tissue- and organism-wide scales. Signals crucial for embryonic development include the TGF-beta superfamily members&#160;bone morphogenetic protein (BMP)&#160;and Nodal1,2,3. During embryogenesis, the pathways regulated by these signals and others pattern the body plan by controlling gene expression and additional processes to ensure that diverse tissues and organs develop and interface properly. Pathologies, including birth defects and cancer, can occur when signaling or responses to signaling are perturbed4,5,6,7. Despite&#160;rigorous investigation into signaling, much more remains to be discovered about how levels and dynamics are decoded in a variety of contexts8,9,10,11, especially during development12,13,14,15,16,17,18,19.
To understand how signaling is decoded, an ideal experiment would be to manipulate signaling levels, timing, and/or dynamics-with a high degree of spatial and temporal control-and assess outcomes. For example, precise spatial signaling gradients are proposed to pattern developing tissues20,21. Altering signaling gradient spatial distributions would help test this hypothesis22. Additionally, the importance of signaling dynamics in generating diverse cellular responses is becoming clearer: The same signaling pathway can instruct cells to differentiate or proliferate depending on signaling frequency, for example9,23. Experimental paradigms in which signaling dynamics can be easily manipulated will be valuable to explore the relationship between dynamics and cell fate decisions8,12,13,14,15.
Historically, multiple methods have been used to manipulate signaling in developmental contexts, leading to fundamental discoveries1,2,3. Signaling can be blocked using pathway loss-of-function mutants, ectopic inhibitor expression, or antagonist drugs. Methods to activate signaling include agonist drugs, recombinant ligands, ectopic expression of ligands or constitutively active receptors, and pathway inhibitor loss-of-function mutants. These methods range along a continuum of experimental control. For example, mutants and ectopic expression may fall on the sledgehammer side of the continuum: With these approaches, dramatic, systemic changes in pathway activity may cause early death and preclude investigations at later stages, or over time may result in pleiotropic effects that are difficult to disentangle. Additionally, it is often challenging to independently manipulate one signaling feature at a time, such as level or duration. Toward the other end of the continuum, some methods offer more precise experimental control, such as microfluidic devices that expose samples to drugs or recombinant proteins with temporal and sometimes spatial control18,24,25, or genetic methods, including heat shock-inducible and tissue-specific promoters that can offer similar benefits16,26,27. However, these methods can be difficult to execute, may not be reversible, may have relatively slow kinetics or poor resolution, and may be unavailable in some model systems.
Molecular optogenetic approaches are a powerful addition to this toolkit. These approaches use proteins that respond to different light wavelengths to manipulate biological processes, including signaling8,12,13,14,15, and have been developed over decades for use in a variety of systems from cell culture to whole animals12,13,28. Compared to historical approaches, molecular optogenetics can often offer a higher degree of spatiotemporal control over biological processes: The controller in optogenetic systems is light, and control of light wavelength, intensity, duration, and exposure frequency is relatively straightforward. With sophisticated systems such as confocal and two-photon microscopes, spatial control in the subcellular range is possible29,30,31. Tools to optogenetically manipulate signaling have been developed and applied in several systems, including those described in Johnson et al.22, &#268;apek et al.32, Krishnamurthy et al.33, and Huang et al.34. For example, exploiting the spatial control afforded by optogenetics, this strategy was recently used to modify a signaling gradient in Drosophila embryos, demonstrating that fly embryogenesis is surprisingly robust to changes in this gradient22. The reversibility and fast on/off kinetics of optogenetic signaling activators have also made them attractive tools for investigating the decoding of signaling dynamics8,12,13,14,15,34,35,36.
The early zebrafish embryo is an in vivo system well-suited for optogenetic studies because it is externally fertilized, transparent, microscopy-friendly, and genetically tractable. Light exposure is easier to deliver to embryos that develop outside of the mother, light can penetrate and access their non-opaque tissues, live zebrafish embryos tolerate imaging well (in addition to being transparent), and existing genetic methods provide straightforward opportunities for knockdown and overexpression experiments, in addition to the development of useful transgenics37.
Recently, optogenetic tools were developed to activate BMP38 and Nodal39 signaling in zebrafish embryos with blue light exposure (Figure 1). We refer to these tools as bOpto-BMP and bOpto-Nodal (b for blue light-activated and Opto for optogenetic). bOpto-BMP/Nodal are based on similar pathway activation mechanisms. The binding of BMP or Nodal ligands to their respective receptor serine-threonine kinases drives receptor kinase domain interactions that lead to the phosphorylation of signaling effectors (Smad1/5/9 for BMP and Smad2/3 for Nodal). Phosphorylated signaling effectors then translocate to the nucleus and regulate target gene expression3 (Figure 1A,D). These receptor kinase interactions can be made light-responsive by coupling receptor kinases to light-responsive dimerizing proteins: With light exposure, these chimeric proteins should dimerize, causing the receptor kinase domains to interact and activate signaling (Figure 1B,C,E,F). Importantly, in contrast to endogenous receptors, bOpto-BMP/Nodal do not contain extracellular ligand-binding domains, ensuring ligand-independent activity (Figure 1C,F). This optogenetic activation strategy was first achieved with receptor tyrosine kinases40,41,42 and then applied to receptor serine-threonine kinases.
bOpto-BMP/Nodal use the blue light-responsive (~450 nm) homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain from the algae Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. These constructs consist of a membrane-targeting myristoylation motif followed by either BMP or Nodal receptor kinase domains, fused to a LOV domain (Figure 1B,E). Blue light exposure should cause LOV homodimerization, resulting in receptor kinase domain interactions that lead to respective Smad phosphorylation and pathway activation (Figure 1C,F). For bOpto-BMP, a combination of constructs with the type I receptor kinase domains from Acvr1l (also known as Alk8) and BMPR1aa (also known as Alk3) and the type II receptor kinase domain from BMPR2a was found to optimally activate signaling38 (Addgene #207614, #207615, and #207616). For bOpto-Nodal, a combination of constructs with the type I receptor kinase domain from Acvr1ba and the type II receptor kinase domain from Acvr2ba is used39.
bOpto-BMP/Nodal have been introduced into early zebrafish embryos by injecting mRNA at the one-cell stage, and used to investigate the role of signaling duration in Nodal interpretation39, to determine why zebrafish lose the ability to respond to Nodal45, and to examine how BMP target genes respond to different BMP signaling levels38. It is likely that these tools will continue to be useful in a diverse range of future investigations. However, the strength of optogenetic signaling activators is also their weakness: light-sensitive samples must be treated with care to avoid inadvertent ectopic signaling activity. Exposure to room light or sunlight can activate bOpto-BMP/Nodal.
This protocol provides practical suggestions for using mRNA-encoded LOV-based BMP and Nodal activators in early zebrafish embryos. It begins by detailing one strategy to build a light box to control uniform light exposure and temperature (Figure 2, Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, Supplementary File 5, Supplementary File 6, Supplementary File 7, Supplementary File 8). It then describes two key control experiments that determine whether an optogenetic signaling activator is behaving as expected-i.e., activating pathway activity only when exposed to light (Figure 3). The first control assay involves examining phenotypes at one day post-fertilization in light-exposed and unexposed embryos (Figure 3A). mRNA-injected light-exposed embryos, but not unexposed embryos, should phenocopy BMP or Nodal overexpression (Figure 4A,B; BMP phenotypes in particular are clearly distinguishable at this time point46). This assay provides a fast activity readout. In the second control assay, to determine whether phenotypes are caused specifically by excess BMP or Nodal signaling and to directly observe the change in signaling levels, immunofluorescence staining is used to detect phosphorylated signaling effectors (pSmad1/5/9 or pSmad2/3, respectively) after a 20 min light exposure around late blastula / early gastrulation stage, when signaling activity has been well described12,16,17,47,48,49,50 (Figure 3B and Figure 4C). (Note that, although spatially localized activation has been demonstrated for both bOpto-BMP38 and bOpto-Nodal39, this protocol only describes uniform light exposure and signaling activation strategies.) It is advisable to execute these control experiments prior to applying bOpto-BMP/Nodal to specific research questions in order to determine ideal local experimental conditions.

Autore in primo piano: Manipolazione della segnalazione negli embrioni di zebrafish per decodificare le decisioni sul destino cellulare 

Attivazione della segnalazione optogenetica negli embrioni di zebrafish

To establish the embryo's body plan during development cells are thought to decode signaling intensities dynamics and combinations. We are using optogenetics to manipulate these signaling features in zebrafish embryos. This approach will help us understand how embryonic cells decode signaling to make some of the earliest sulfate decisions The optogenetic approaches discussed here use light as a remote control to activate BMP or nodal signaling rapidly and reversibly.Because light exposure is easy to direct, these approaches can offer improved experimental control over signaling. Our protocol introduces using these light sensitive tools in zebrafish embryos. With this improved temporal and spatial control, it should now be possible to perform precise signaling modifications during zebrafish developments.We expect this to deepen our understanding of how cells decode signaling to make faint decisions, which will help reveal how the embryonic body plan develops.

L'obiettivo dei due esperimenti di controllo qui descritti è quello di determinare se bOpto-BMP/Nodal attivano i rispettivi percorsi in risposta all'esposizione alla luce blu senza influenzare la segnalazione in assenza di luce, come previsto. Utilizzare questi controlli per stabilire il flusso di lavoro sperimentale appropriato nel laboratorio prima di applicare bOpto-BMP/Nodal alle domande di ricerca di interesse.
Il test di fenotipizzazione può essere completato in soli 2 giorni e fornisce un'utile indicazione dell'attività di segnalazione e della fototossicità (Figura 3A). Gli embrioni iniettati esposti alla luce blu dovrebbero fenocopiare l'eccesso di segnalazione BMP (ventralizzazione46; Figura 4A, pannello di sinistra) o segnalazione linfonodale (difetti di sviluppo correlati all'extra mesendoderma 1,3,47,57,58,59,60 (Figura 4A, pannello di destra)). Se iniettati, gli embrioni esposti alla luce sono afenotipici, testare la qualità dell'mRNA e prendere in considerazione l'idea di iniettarne di più, e ricontrollare la strategia di esposizione alla luce per garantire un'esposizione costante alla luce intensa (~450 nm di luce con un irraggiamento di 45 W/m2 dovrebbe attivare fortemente la segnalazione). Al contrario, gli embrioni iniettati e non esposti dovrebbero avere un aspetto identico ai fratelli non iniettati. Se iniettati, gli embrioni non esposti presentano fenotipi, ridurre la quantità di mRNA iniettato e rivalutare l'impostazione sperimentale per garantire che gli embrioni non esposti siano protetti dall'esposizione alla luce. I dati mostrati nella Figura 4B mostrano i risultati di tipici esperimenti di fenotipizzazione con quantità di mRNA e condizioni di esposizione appropriate: una forte attività di segnalazione è evidente negli embrioni iniettati ed esposti alla luce, con solo una piccola frazione di embrioni iniettati e non esposti che presentano fenotipi.
Il test di fenotipizzazione offre anche l'opportunità di valutare la fototossicità. Se la fototossicità è trascurabile, gli embrioni non iniettati ed esposti alla luce dovrebbero apparire wild type, simili agli embrioni non iniettati e non esposti. Se gli embrioni non iniettati ed esposti alla luce presentano difetti, ma non gli embrioni non iniettati e non esposti, prendere in considerazione la possibilità di ridurre l'irradiazione luminosa. Un'irradianza di 45 W/m2 attiva in modo robusto la segnalazione senza evidente fototossicità. I dati mostrati nella Figura 4B non mostrano differenze preoccupanti tra gli embrioni non iniettati, esposti alla luce e non iniettati, non esposti, indicando una fototossicità trascurabile.
Sebbene i saggi di immunofluorescenza richiedano più tempo e impegno (~1 settimana) rispetto al test di fenotipizzazione (2 giorni), la colorazione in immunofluorescenza fornisce una lettura diretta dell'attività della via di segnalazione e può rivelare sottili cambiamenti di segnalazione che potrebbero non essere riflessi dalla morfologia grossolana. L'immunofluorescenza è particolarmente importante per valutare le risposte a bOpto-Nodale, perché l'eccesso di segnalazione linfonodale spesso provoca la lisi embrionale di 1 dpf - che può avere molte cause - in contrasto con i fenotipi specifici di ventralizzazione caratteristici dell'eccesso di segnalazione BMP46 (Figura 4A). Gli embrioni iniettati esposti alla luce blu dovrebbero mostrare un aumento uniforme della fosforilazione di Smad1/5/9 o Smad2/3 rispetto agli embrioni non iniettati ed esposti alla luce. Se i livelli non aumentano, o aumentano solo debolmente, testare la qualità dell'mRNA e prendere in considerazione l'iniezione di più, e ricontrollare la strategia di esposizione alla luce. Un'esposizione di 20 minuti alla luce blu con un'irradianza di 45 W/m2 intorno al 40% di epibolia dovrebbe attivare fortemente la segnalazione. Se la colorazione di pSmad non è uniforme, prova a iniettare l'mRNA al centro della cellula (piuttosto che nel tuorlo), il che può comportare una distribuzione più uniforme dell'mRNA.
Gli embrioni iniettati e non esposti dovrebbero avere livelli di pSmad paragonabili a quelli degli embrioni non iniettati. Aneddoticamente, abbiamo osservato una fosforilazione di Smad più permeabile con bOpto-Nodal rispetto a bOpto-BMP. Se i livelli di pSmad sono aumentati negli embrioni iniettati e non esposti, ridurre la quantità di mRNA iniettato. Inoltre, rivalutare l'impostazione sperimentale per garantire che 1) gli embrioni non esposti non siano inavvertitamente esposti alla luce e 2) che l'esposizione alla luce durante la fissazione sia minima. Durante la fase di fissazione, è fondamentale far trascorrere non più di 45 secondi tra la rimozione dalla scatola luminosa e l'immersione in formaldeide. Inoltre, durante questa fase, ridurre al minimo l'esposizione alla luce della stanza e alla luce solare chiudendo le persiane delle finestre, spegnendo le fonti di luce bianca, utilizzando luci rosse o coprendo le fonti di luce bianca con carta da filtro gel che blocca la luce blu (Tabella dei materiali).
I dati nella Figura 4C mostrano i risultati di tipici esperimenti di colorazione in immunofluorescenza con quantità di mRNA appropriate e condizioni di esposizione alla luce: i livelli di pSmad sono simili negli embrioni non iniettati e non esposti, mentre gli embrioni iniettati ed esposti alla luce mostrano livelli più elevati di fosforilazione di Smad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig01.jpg"> Figura 1: Strategia di attivazione del segnale bOpto-BMP e -Nodale . (A) La via di segnalazione endogena del BMP è attivata dal legame del ligando BMP, che porta alla formazione di un complesso recettoriale di tipo I/II, alla fosforilazione di Smad1/5/9 e all'espressione dei geni bersaglio del BMP. I recettori di tipo I BMPR1aa e Acvr1l sono noti anche come Alk3 e Alk8, rispettivamente. BMPR2a è un recettore di tipo II. (B) costrutti bOpto-BMP38. I domini chinasici putativi di BMPR1aa e Acvr1l sono fusi con LOV; la fusione BMPR2a-LOV contiene il dominio chinasico putativo e il dominio C-terminale del recettore (CTD). Tutte le fusioni sono mirate alla membrana con un motivo di miristoilazione (Myr). I domini sono separati da linker glicina-serina (GS). I costrutti sono contrassegnati nel CTD con un tag epitopo HA. Si è scoperto che questa combinazione di tre costrutti attiva in modo ottimale la segnalazione BMP. (C) Attivazione del segnale BMP mediata da bOpto-BMP. Se esposti alla luce blu, i domini LOV si dimerizzano, il che si pensa inneschi la formazione di complessi e l'attivazione della segnalazione. (D) La via di segnalazione endogena nodale è attivata dal legame del ligando nodale, che porta alla formazione di un complesso recettoriale di tipo I/II, alla fosforilazione di Smad2/3 e all'espressione di geni bersaglio nodali. Il recettore di tipo I Acvr1ba e il recettore di tipo II Acvr2ba sono noti anche come Acvr1b e Acvr2b, rispettivamente. (E) costrutti bOpto-Nodali39. I domini chinasici putativi di Acvr1ba e Acvr2ba sono fusi con LOV. Tutte le fusioni sono mirate alla membrana con un motivo di miristoilazione (Myr). I domini sono separati da linker GS. I costrutti sono contrassegnati nel CTD con un tag epitopo HA. (F) Attivazione del segnale nodale mediata da bOpto-Nodale. Se esposti alla luce blu, i domini LOV si dimerizzano, il che si pensa inneschi la formazione di complessi e l'attivazione della segnalazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig02.jpg"> Figura 2: Scatola luminosa a temperatura controllata per esperimenti di optogenetica . (A) Un illuminatore per micropiastre a LED è montato sulla parte superiore di un'incubatrice utilizzando un supporto LED personalizzato. Gli embrioni di pesce zebra in una piastra a 6 pozzetti sul primo ripiano sono esposti alla luce attraverso un foro praticato nella parte superiore dell'incubatrice. Il ripiano inferiore contiene una seconda serie di embrioni di controllo non esposti in una piastra a 6 pozzetti avvolta in un foglio di alluminio. La porta dell'incubatrice è rivestita con guarnizioni per evitare l'esposizione involontaria alla luce della stanza o alla luce solare. (B) Dettaglio della procedura per creare un foro nell'incubatrice utilizzando un trapano a gradino. Il modello di incubatrice qui utilizzato ha un pannello interno che ha richiesto la pratica di un secondo foro più grande (Tabella dei materiali). (C) Dettaglio del supporto LED personalizzato progettato per un sistema di illuminazione a tre lunghezze d'onda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig03.jpg"> Figura 3: Flusso di lavoro dell'esperimento bOpto-BMP/Nodale. Saggio del fenotipo e colorazione in immunofluorescenza pSmad per testare l'attività di bOpto-BMP/Nodal. Gli embrioni vengono iniettati con mRNA allo stadio monocellulare e trasferiti in una scatola luminosa entro e non oltre 1,5 ore dalla fecondazione (hpf). (A) Saggio del fenotipo. Gli embrioni iniettati e i fratelli non iniettati vengono allevati al buio o esposti a una luce blu uniforme a partire da 1,5 hpf fino a 1 giorno dopo la fecondazione (dpf). L'attività di segnalazione optogenetica può essere valutata assegnando un punteggio agli embrioni per fenotipi coerenti con l'eccesso di attività della via. (B) colorazione in immunofluorescenza pSmad. Gli embrioni iniettati e i fratelli non iniettati vengono allevati al buio fino al 40% di epibolia (~6 hpf). Metà degli embrioni iniettati e metà di quelli non iniettati vengono quindi esposti a una luce blu uniforme per 20 minuti. Dopo l'esposizione, tutti gli embrioni vengono fissati e sottoposti a colorazione in immunofluorescenza per pSmad. Livelli elevati di pSmad1/5/9 o pSmad2/3 riflettono rispettivamente l'attivazione optogenetica della segnalazione BMP o nodale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig04.jpg"> Figura 4: Valutazione delle risposte di segnalazione attivate dalla luce in embrioni di zebrafish. Gli embrioni di zebrafish sono stati iniettati allo stadio di una cellula con mRNA codificante per bOpto-BMP/Nodal. (A) Gli embrioni sono stati allevati al buio o esposti a luce blu uniforme a partire da 1,5 ore dopo la fecondazione (hpf). I fenotipi sono stati valutati a 1 giorno dopo la fecondazione (dpf). Vengono mostrati fenotipi rappresentativi. L'eccesso di segnalazione BMP porta alla ventralizzazione (pannello sinistro), mentre l'eccesso di segnalazione linfonodale causa difetti di sviluppo associati a un ulteriore mesendoderma (pannello destro). Barra della scala = 500 μm. (B) Quantificazione del fenotipo. Gli embrioni iniettati e i fratelli non iniettati sono stati allevati al buio a partire da 1,5 hpf (bulbo nero). Metà degli embrioni iniettati e metà di quelli non iniettati sono stati esposti a una luce blu uniforme (lampadina blu). (C) Gli embrioni iniettati e i fratelli non iniettati sono stati allevati al buio a partire da 1,5 hpf (bulbo nero). Al 40% di epibolia (~6 hpf), metà degli embrioni iniettati e metà di quelli non iniettati sono stati esposti a luce blu uniforme (lampadina blu). Dopo 20 minuti, tutti gli embrioni sono stati fissati e sottoposti a colorazione in immunofluorescenza per Smad1/5/9 o Smad2/3 fosforilati. Intensità di pSmad più elevate indicano rispettivamente un aumento della segnalazione BMP/Nodale. Barra della scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: Assemblaggio completo della scatola luminosa. File PDF 3D che mostra una vista 3D dell'assieme completo della scatola luminosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_1_Light_box_full_assembly_2023-08-15.PDF" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 2: Vista esplosa della scatola luminosa. File PDF 3D che mostra una vista 3D dell'assieme light box esploso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_2_Light_box_exploded_view_2023-08-15.PDF" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 3: Guarnizione luce grande. File di disegno CAD (. DWG) per fabbricare la grande guarnizione della luce per il supporto del LED utilizzando una taglierina laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_3_Large_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 4: Guarnizione leggera piccola. File di disegno CAD (. DWG) per fabbricare la piccola guarnizione luminosa per il supporto del LED utilizzando una taglierina laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_4_Small_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 5: Base della piattaforma in acrilico. File di disegno CAD (. DWG) per fabbricare la base della piattaforma acrilica del supporto del LED utilizzando una taglierina laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_5_Acrylic_platform_base_2023-08-15.DWG" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 6: Piattaforma acrilica verticale. File di disegno CAD (. DWG) per fabbricare la piattaforma acrilica del supporto LED verticale utilizzando una taglierina laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_6_Acrylic_platform_vertical_2023-08-15.DWG" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 7: Supporto acrilico a sinistra. File di disegno CAD (. DWG) per fabbricare il supporto sinistro in acrilico del supporto LED utilizzando una taglierina laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_7_Acrylic_support_left_2023-08-15.DWG" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 8: Supporto acrilico a destra. File di disegno CAD (. DWG) per fabbricare il supporto destro in acrilico del supporto LED utilizzando una taglierina laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_8_Acrylic_support_right_2023-08-15.DWG" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

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La manipolazione optogenetica delle vie di segnalazione può essere una potente strategia per studiare come la segnalazione viene decodificata nello sviluppo, nella rigenerazione, nell'omeostasi e nella malattia. Questo protocollo fornisce linee guida pratiche per l'utilizzo di attivatori di segnalazione della proteina morfogenica (BMP) nodale e della proteina morfogenica ossea (BMP) basati sul dominio di rilevamento della luce-ossigeno-voltaggio nell'embrione precoce di zebrafish.

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Per stabilire il piano corporeo dell'embrione durante lo sviluppo, si pensa che le cellule decodifichino l'intensità del segnale, le dinamiche e le combinazioni. Stiamo usando l'optogenetica per manipolare queste caratteristiche di segnalazione negli embrioni di zebrafish. Questo approccio ci aiuterà a capire come le cellule embrionali decodificano la segnalazione per prendere alcune delle prime decisioni sui solfati Gli approcci optogenici qui discussi utilizzano la luce come telecomando per attivare la segnalazione BMP o nodale in modo rapido e reversibile.Poiché l'esposizione alla luce è facile da direzionare, questi approcci possono offrire un migliore controllo sperimentale sulla segnalazione. Il nostro protocollo introduce l'uso di questi strumenti sensibili alla luce negli embrioni di zebrafish. Con questo migliore controllo temporale e spaziale, dovrebbe ora essere possibile eseguire precise modifiche di segnalazione durante lo sviluppo del pesce zebra.Ci aspettiamo che questo approfondisca la nostra comprensione di come le cellule decodificano la segnalazione per prendere decisioni deboli, il che aiuterà a rivelare come si sviluppa il piano corporeo embrionale.

optogenetic-signaling-activation-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

1.5K Views.  NIH. Per stabilire il piano corporeo dell'embrione durante lo sviluppo, si pensa che le cellule decodifichino l'intensità del segnale, le dinamiche e le combinazioni. Stiamo usando l'optogenetica per manipolare queste caratteristiche di segnalazione negli embrioni di zebrafish. Questo approccio ci aiuterà a capire come le cellule embrionali decodificano la segnalazione per prendere alcune delle prime decisioni sui solfati Gli approcci optogenici qui discussi utilizzano la luce come telecomando p...

Video: Autore in primo piano: Manipolazione della segnalazione negli embrioni di zebrafish per decodificare le decisioni sul destino cellulare 

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Injecting bOpto-BMP&#47;Nodal Constructs into Zebrafish Embryos 

Injecting bOpto-BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos   

To begin, use an incubator and an LED Microplate Illuminator to create a light box for controlling light exposure and temperature. Then, position a six well plate on the upper shelf of the incubator, and check whether the light beam evenly encompasses it. Use a sheet of paper to visualize the distribution of light coverage.Use a light meter to measure irradiance and spatial uniformity. At least one day before injections, make injection dishes and agarose-coated six well plates. Rinse an injection dish mold with embryo medium, and place gently onto molt and agarose.Once the agarose has solidified, delicately use the tab to remove the mold. Next, prepare flamed glass pipettes for immunofluorescence experiments on dechlorinated embryos. Place the end of a glass pipette into a bun and burner flame, and rotate continuously until the edges become smooth.Prepare an injection mix using the mRNAs shown here. For the phenotyping assay, introduce the needle through the corion directly into the center of the cell at the one cell stage, and inject one nanoliter of the injection mix. If conducting an immunofluorescence assay, target the center of the cell of coated embryos at the one cell stage.For both assays, prepare enough embryos for the unexposed non-injected, unexposed injected, exposed non-injected, and exposed injected embryos. Select at least 30 embryos per condition. For the immunofluorescence assay, prepare an additional dish containing non-injected embryos as a proxy to assess the progression of developmental stages.After injection, incubate the embryos in Petri dishes at 28 degrees Celsius.

Iniezione di costrutti bOpto-BMP/nodali in embrioni di zebrafish 

Light Exposure Experiment to Activate BMP or Nodal Signaling in Zebrafish

To begin, incubate the injected zebrafish embryos at 28 degrees Celsius. Around 1.5 HPF at the four to 16 cell stage, remove unfertilized and unhealthy embryos. For the phenotyping assay, wrap the unexposed control plate with noninjected and injected embryos in aluminum foil.Position the foil covered plate on the lower shelf, and the exposed plate on the upper shelf of the 28 degrees Celsius light box. After confirming that the dish cover is in place, activate the blue light, and shut the light box door to prevent unintended room light exposure. For the immunofluorescence assay around 1.5 HPF, individually wrap the exposed and unexposed dishes in aluminum foil while keeping the proxy dish unwrapped.Put all the dishes in the 28 degrees Celsius light box without activating the LED. Close the light box door to prevent inadvertent exposure to room light. At approximately five HPF, use a dissecting scope to evaluate the developmental stage of the proxy embryos.Also remove the wrapped dishes to ensure uniform temperature exposure across all dishes. Once the proxy embryos reach 40%epiboly, uncover the exposed dish and place it on the upper shelf of the light box. Keep the unexposed dish covered on the lower shelf.Immediately activate the blue light, close the door, and set a timer for 20 minutes. To prepare for fixation, eliminate as much room light as possible. Just before fixation, take tubes containing 4%formaldehyde from four degrees Celsius and position them beside the light box.After 20 minutes, open the door of the light box and remove the dish that wasn't exposed to light. Use a flamed glass pipette tip to remove the light sensitive embryos from the dish. Then to immerse the embryos in 4%formaldehyde, submerge the flamed glass pipette tip in the formaldehyde, and allow the embryos to sink into the liquid.Store fixed embryos at four degrees Celsius overnight.

Esperimento di esposizione alla luce per attivare la BMP o la segnalazione nodale nel pesce zebra

Evaluation of bOpto-BMP&#47;Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment

Evaluation of bOpto-BMP/Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment  

For the phenotyping assay, perform the light exposure experiment on bOpto-BMP bOpto-Nodal expressing zebrafish embryos, and remove them from the light box at one day post-fertilization between 24 to 32 HPF. Using a dissecting scope, evaluate phenotypes and establish a scoring rubric. Assess embryos while they remain within the chorion for convenience.Utilize a pipette to probe to reposition embryos for viewing from different angles. For the immunofluorescence assay, after incubating embryos in 4%formaldehyde at four degrees Celsius overnight, remove the formaldehyde and rinse them three to five times with PBST. Discard the PBST and add 100%methanol.Seal the tubes and gently invert them to mix residual PBST and methanol. After washing the embryos two more times with methanol, store them at minus 20 degrees Celsius for at least two hours up to several years. Using a microscope equipped for optical sectioning, capture images of immunostained embryos.Immunofluorescent staining experiments with appropriate mRNA amounts and light exposure conditions showed that the pSmad levels were similar and non-injected in unexposed embryos, whereas injected light exposed embryos exhibited higher levels of Smad phosphorylation.