Per iniziare, pipettare 50 microlitri di campioni NET di ratto isolati in una provetta con 450 microlitri di tampone Tris-EDTA. Ora pipettare 100 microlitri di standard di DNA e i campioni in una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere un volume uguale di reagente del saggio nei pozzetti.
Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per due-cinque minuti, evitando l'esposizione alla luce diretta. Collocare la piastra in un lettore per micropiastre a fluorescenza. Impostare uno spettro di emissione di circa 530 nanometri e uno spettro assorbente di circa 480 nanometri.
Incubare le cellule in un microlitro di colorante per 30 minuti. Successivamente, incubare le cellule in un microlitro di ceppo di DNA privo di cellule per 10 minuti. Mescolare delicatamente i coloranti fluorescenti.
Caricare la piastra del campione nel citometro. Passare al canale SYTOX Green, quindi selezionare il canale HEXT. Impostare l'illuminazione su Blu 377/447 e regolare il tempo di esposizione a 300.000 microsecondi.
Fare clic su Impostazione messa a fuoco, quindi fare clic su Registra auto per regolare automaticamente la messa a fuoco. Selezionare il canale SYTOX Green e impostare l'illuminazione su Green 483/536. Impostare il tempo di esposizione per SYTOX Green su 30.000 microsecondi.
Fare clic su Avvia scansione per avviare il processo di scansione. Risposte comparabili nella secrezione NET sono state distinguibili tra neutrofili periferici e del midollo osseo indipendentemente dalla stimolazione PMA. I NET di ratto hanno anche mostrato limitate capacità di reticolazione tra loro.
L'incubazione con PMA ha portato a un aumento del 10% del contenuto di DNA libero da cellule dopo quattro ore, indicando una maggiore propensione a innescare la formazione di NET.
