Per iniziare, posizionare gli inserti per colture cellulari in una piastra adattatore per coltura tissutale a 24 pozzetti. Pre-rivestire il lato apicale degli inserti con 100 microlitri di matrice extracellulare della membrana basale o BME in terreni di crescita enteroidei. Rivestire un inserto aggiuntivo da utilizzare come controllo durante le misurazioni dell'integrità della barriera.
Successivamente, incubare l'inserto rivestito a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per un'ora. Una volta completata l'incubazione, aspirare il terreno di coltura enteroide 3D. Raccogliere gli enteroidi ileali bovini in 1 millilitro di terreno di lavaggio ghiacciato.
Usa un raschietto per celle per staccare le cupole e raccoglierle in un tubo conico da 15 millilitri. Con un puntale per pipetta da 1 millilitro, triturare 30 volte per generare frammenti enteroidei. Successivamente, utilizzare un puntale per pipette da 200 microlitri per triturare ulteriormente circa 40 volte per rompere i frammenti enteroidei.
Aumentare il volume del tubo a 10 millilitri con un mezzo di lavaggio ghiacciato. Quindi centrifugare la provetta a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cura il surnatante, compreso lo strato BME.
Successivamente, per ogni quattro cupole, risospendere il pellet in 1 millilitro di enzima espresso TrypLE preriscaldato. Trasferire la miscela su una piastra da 24 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per 10 minuti. Pipettare delicatamente la miscela con una pipetta da 1 millilitro per abbattere ulteriormente gli enteroidi.
Quindi pipettare la miscela con una pipetta da 200 microlitri per rompere i frammenti in singole cellule. Utilizzare una siringa da 3 millilitri dotata di un ago sterile calibro 22 per aspirare ed erogare la sospensione cellulare quattro volte per ottenere una sospensione a cellula singola. Con un microscopio, monitora la dissociazione cellulare fino a quando l'80% degli enteroidi non viene scomposto in singole cellule.
Ora raccogli la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere quattro volumi di terreno di lavaggio FBS per estinguere la reazione. Quindi filtrare gli enteroidi attraverso un filtro cellulare pre-rivestito da 40 micrometri due volte in un tubo conico da 50 millilitri.
Centrifugare la sospensione a 300 g per cinque minuti per pellettare le cellule. Aspirare il surnatante nella provetta da centrifuga della sospensione dissociata di cellule enteroidiche ileali bovine. Risospendere il pellet in un piccolo volume di terreno di crescita organoide.
Successivamente, utilizzare il metodo di esclusione del colorante Trypan Blue e l'emacitometro per determinare la vitalità cellulare. Rimuovere con cautela la soluzione di rivestimento in eccesso dall'inserto per colture cellulari. Seminare i 200 microlitri della sospensione a cellula singola sulla superficie apicale di un inserto di coltura prerivestito.
A questo punto, aggiungere 700 microlitri di terreno completo FBS sul lato laterale basale dell'inserto. Muovi la piastra circa 10 volte nella forma del numero otto per distribuire uniformemente le celle sull'inserto. Quindi posizionare la piastra sullo scaldapiatti nell'armadio di biosicurezza per 10 minuti.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica a 48 ore. Dopo l'incubazione, sostituire il terreno sulle componenti apicali e basali con terreno di crescita enteroide fresco. Il giorno successivo, rimuovere il terreno dai compartimenti laterali apicale e basale.
Lavare accuratamente l'inserto con PBS e sostituirlo con mezzi di differenziazione enteroidei, integrati solo con inibitori. La formazione dell'enterosfera è stata osservata poche ore dopo la coltura delle cripte bovine placcate. Dopo due giorni, il lume delle sfere era ben definito, con strutture in gemmazione osservate al quarto giorno.
Gli enteroidi maturi sono stati osservati entro il settimo giorno. L'immunocolorazione degli enteroidi 3D di sette giorni ha mostrato la presenza di diverse linee cellulari. La proteina E-caderina è stata localizzata alla giunzione di aderenza.
Gli enteroidi erano positivi per le cellule enteroendocrine e per le cellule Paneth produttrici di lisozima. I monostrati 2D confluenti sono stati osservati in meno di una settimana di coltura.
