Per iniziare, usa le pinze per rimuovere il grasso e il tessuto connettivo dalla ghiandola salivare sottomandibolare sezionata di un topo sottoposto a eutanasia. Quindi posizionare la ghiandola in una provetta di raccolta con una soluzione HBSS ghiacciata. Quindi, usa le pinze per tagliare la ghiandola in pezzi quadrati di un centimetro.
Scaldare l'agarosio al 4% a 50 gradi Celsius e versare la soluzione in un piatto da 35 millimetri. Versare una piccola quantità di soluzione di agarosio in un piatto separato e aggiungere i pezzi della ghiandola. Quindi far roteare i pezzi nell'agarosio in eccesso per ricoprirlo.
Quindi metti da quattro a sei pezzi della ghiandola piatta nel primo piatto con l'agarosio. Metti il coperchio sul piatto e trasferiscilo in una ghiacciaia, coprendo il piatto con ghiaccio per raffreddare e solidificare. Per sezionare i pezzi della ghiandola, per prima cosa, usa un bisturi per tagliare con cura intorno al blocco di agarosio incorporato nella ghiandola.
Successivamente, applica una goccia di super colla sul blocco di agarosio e attaccalo al tavolino di un vibratomo. Ora riempi la camera del vibratomo con PBS ghiacciato contenente l'1% di streptomicina penicillina. Con un bisturi, taglia l'agarosio in eccesso e crea spazi di cinque millimetri tra ogni pezzo di ghiandola.
Allineare la lama del vibratomo con il blocco di agarosio e impostare i punti di inizio e fine delle sezioni. Tagliare il blocco di tessuto in sezioni spesse 150 micrometri a bassa velocità e ad alte vibrazioni. Una volta che le sezioni sono state tagliate, usa un pennello per raccogliere le fette e mettile in un piatto con terreno RPMI preriscaldato contenente gli antibiotici.
Per coltivare le fette sottomandibolari, aggiungere prima 1,5 millilitri di terreno RPMI ai pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Posizionare filtri da 0,4 micrometri nei pozzetti. Successivamente, con l'aiuto di un pennello, trasferisci con cura da una a sei fette su ciascun filtro.
Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Dopo aver irradiato alcune piastre sperimentali con radiazioni gamma per indurre lesioni, rimettere le piastre nell'incubatrice. Successivamente, riempire i pozzetti di una piastra da 24 pozzetti con 500 microlitri di terreno di coltura.
Con un pennello, sollevare le fette dal filtro e immergerle delicatamente nei pozzetti. Incubare le fette nelle relative colorazioni nucleari. Quindi incubare le fette con gli anticorpi per due ore a 37 gradi Celsius sotto leggera agitazione.
Immergere le fette nei terreni di coltura tre volte per lavarle. Lasciare incubare le fette in ogni soluzione di lavaggio per 10 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Successivamente, utilizzare le pinze per rimuovere il nastro da un distanziatore di imaging biadesivo.
Attaccare il distanziatore sul fondo di una piastra a sei pozzetti con fondo in vetro, quindi pipettare 50 microlitri di terreno nella fessura al centro del distanziatore. Posizionare la fetta nel supporto assicurandosi che sia piatta. Quindi, con una pipetta, rimuovere con cautela 20 microlitri di terreno dalla fessura.
Usa una pinza per rimuovere con cautela il nastro dal lato superiore del distanziatore e posiziona su di esso un vetrino circolare da 25 millimetri. Premere attorno ai bordi del distanziatore per garantire un fissaggio saldo del vetrino coprioggetto. Visualizzare la fetta su un microscopio confocale.
Le fette non irradiate della ghiandola sottomandibolare coltivate per sette giorni hanno mantenuto il loro segnale MT e l'architettura epiteliale. Tuttavia, a tre giorni dall'irradiazione, è stata osservata atrofia delle cellule acinari e duttali. Cellule positive alla caspasi sono state osservate quattro giorni dopo l'irradiazione.
Elevati livelli di gamma H2AX sono stati osservati nelle fette irradiate, indicativi di danni al DNA in vivo. L'imaging in tempo reale dei macrofagi ha confermato la fagocitosi delle cellule epiteliali nel modello di coltura a fette. Le singole cellule possono essere rilevate e segmentate per la successiva analisi del comportamento cellulare, come la migrazione.
