SE è finanziato dalla sovvenzione Wellcome Trust 108906/Z/15/Z; EE è finanziato dalla sovvenzione UKRI/MRC MR/S005544/1 e da una Chancellor's Fellowship dell'Università di Edimburgo. La Figura 1A viene creata con BioRender.com.

Tutte le procedure sono state approvate dal Ministero dell'Interno del Regno Unito ed eseguite secondo le PPL PB5FC9BD2 e PP0330540. Tutti gli esperimenti sono in linea con le linee guida di ARRIVE e con quelle dell'Università di Edimburgo.
I topi wild-type sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali). Krt14CreER; I topiR26 mTmG sono stati allevati in casa, incrociando topi Krt14CreER/+ 31 con topi R26 mTmG/mTmG 32. In tutti gli esperimenti, sono stati utilizzati topi femmina di 8-10 settimane.
1. Raccolta e incorporamento della mitraglietta
<ol><li>Sopprimere il topo o i topi esponendoli a una concentrazione crescente di anidride carbonica (CO2 ). Successivamente, spruzzare l'area dell'incisione con etanolo al 70% (EtOH) e utilizzare forbici e pinze per sezionare accuratamente le mitragliatrici dal tessuto circostante (Figura 1A). Rimuovere il grasso e il tessuto connettivo utilizzando una pinza e posizionare la ghiandola in una provetta di raccolta contenente una soluzione salina bilanciata Hanks ghiacciata (HBSS, vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Separare la ghiandola in pezzi di circa 1 cm2 ciascuno usando una pinza.</li>
	<li>Scaldare il 4% di agarosio a 50 °C, quindi versarlo direttamente in una pirofila da 35 mm.</li>
	<li>Versare una piccola quantità di agarosio fuso a 50 °C in un piatto separato e sciacquare accuratamente la ghiandola muovendola nell'agarosio in eccesso. NOTA: Questo passaggio è necessario per rimuovere il liquido in eccesso dalle ghiandole. Un eccesso di liquidi può impedire alle ghiandole di aderire correttamente all'agarosio.</li>
	<li>Posizionare 4-6 pezzi della ghiandola nell'agarosio, assicurandosi che siano piatti e sullo stesso piano (Figura 1A). NOTA: Assicurarsi che le ghiandole non tocchino la superficie dell'agar o il fondo della piastra.</li>
	<li>Metti il coperchio sulla teglia da 35 mm e trasferiscila in una ghiacciaia, coprendo la piastra con ghiaccio.</li>
	<li>Attendere 5-10 minuti affinché l'agarosio si solidifichi.</li>
</ol>2. Sezionamento
<ol><li>Usa un bisturi per tagliare con cura intorno al blocco di agarosio incorporato nella ghiandola, rimuovendo il blocco contenente il tessuto dal piatto. Lasciare un bordo di circa 5 mm.</li>
	<li>Fissare il blocco di agarosio al tavolino del vibratomo (vedi Tabella dei materiali) applicando una goccia di supercolla, assicurandosi che l'intera superficie inferiore del blocco sia a contatto con la supercolla.</li>
	<li>Lasciare indurire la supercolla per circa 5 minuti. Quindi, riempire la camera del vibratomo con soluzione salina tamponata con fosfato 1x ghiacciata (PBS) contenente l'1% di penicillina-streptomicina (P/S).</li>
	<li>Aggiungere ghiaccio sia sul lato che sul fondo della camera del vibratomo. NOTA: Mantenere un ambiente molto freddo e sostituire il ghiaccio secondo necessità.</li>
	<li>Tagliare l'agarosio in eccesso e creare spazi di 5 mm tra ogni pezzo di ghiandola praticando delle incisioni con un bisturi. In questo modo si otterranno singole fette.</li>
	<li>Allineare la lama del vibratomo con la faccia del blocco di agarosio e impostare i punti iniziale e finale delle sezioni per ottenere lo spessore della fetta desiderato.</li>
	<li>Prima di iniziare il processo di taglio, assicurarsi che la lama non sia a contatto con il blocco. Questa precauzione eviterà di tagliare accidentalmente grossi pezzi di agarosio e di perdere parti del campione.</li>
	<li>Tagliare sezioni con uno spessore di 150 μm a bassa velocità e vibrazioni elevate (ad esempio, una velocità di 3 e un'impostazione di vibrazione di 8-10 su una scala di 1-10 per ciascun parametro) (Figura 1A).</li>
	<li>Una volta che una sezione è stata tagliata e rilasciata nel PBS circostante, raccogliete le sezioni usando un pennello e mettetele in un piatto contenente supporti preriscaldati del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con P/S.</li>
</ol>3. Coltivazione e colorazione di fette di SMG
<ol><li>Coltura<ol><li>Aggiungere 1,5 mL di terreno RPMI a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenente un filtro da 0,4 μm. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate sotto il filtro.</li>
		<li>Trasferisci 1-6 fette su ogni filtro usando un pennello, facendo attenzione a non rompere le fette. NOTA: Assicurarsi che le fette non siano immerse nel supporto, ma che fluttuino sul filtro. Se sono completamente sommersi, possono soffocare durante la coltura.</li>
		<li>Incubare a 37 °C con il 5% di CO2 e cambiare il terreno ogni 3 giorni (Figura 1A).</li>
		<li>Irradiare le piastre sperimentali con una singola dose di radiazioni gamma a 10 Gy utilizzando un irradiatore disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali). Successivamente, rimettili nell'incubatrice.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione per l'imaging dal vivo<ol><li>Usando un pennello, sollevare delicatamente le fette dal filtro e posizionarle in una piastra da 24 pozzetti contenente 500 μL di terreno di coltura per pozzetto, dove le fette verranno immerse.</li>
		<li>Aggiungere gli anticorpi coniugati e il colorante nucleare pertinenti (vedere la tabella dei materiali) al terreno alle concentrazioni appropriate27.</li>
		<li>Incubare le fette con gli anticorpi per 2 ore a 37 °C agitando delicatamente.</li>
		<li>Lavare le fette immergendole in terreni di coltura e lavandole per 3 giri da 10 minuti di lavaggio a 37 °C con leggera agitazione.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Montaggio e imaging dal vivo
<ol><li>Usando una pinza, rimuovere il nastro da un lato di un distanziatore di imaging su entrambi i lati e farlo aderire, con il lato adesivo rivolto verso il basso, al fondo di una piastra a 6 pozzetti con fondo in vetro.</li>
	<li>Pipettare 50 μL di terreno nella fessura al centro del distanziatore.</li>
	<li>Posiziona la fetta nel supporto usando un pennello, assicurandoti che sia piatta senza bolle d'aria intrappolate.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta, rimuovere con cautela 20 μL di terreno dalla fessura.</li>
	<li>Rimuovere il nastro dal lato superiore del distanziatore utilizzando una pinza e posizionare un vetrino coprioggetti circolare da 25 mm sulla parte superiore. Premere intorno al bordo del distanziatore per assicurarsi che il vetrino coprioggetto si attacchi saldamente, facendo attenzione a non rompere il vetrino coprioggetto applicando troppa forza (Figura 1A).</li>
	<li>Visualizzare la fetta su un microscopio confocale per il periodo di tempo o gli intervalli desiderati (ad esempio, ogni 15 minuti per 12 ore utilizzando un obiettivo d'acqua 20x).</li>
</ol>

Imaging in tempo reale della rigenerazione della ghiandola sottomandibolare del topo

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

La capacità di coltivare il tessuto delle ghiandole salivari ex vivo rappresenta un'eccellente opportunità per studiare le interazioni cellula-cellula nel contesto sia dell'omeostasi che della risposta alle lesioni. Sebbene l'imaging intravitale della ghiandola sottomandibolare di topo sia fattibile39,40, questa tecnica dipende dall'utilizzo di modelli murini reporter fluorescenti per etichettare endogenamente le cellule di interesse e deve essere eseguita in anestesia terminale. Qui, viene descritto un metodo per coltivare fette di ghiandola sottomandibolare ex vivo, mantenendo l'architettura cellulare e le interazioni cellula-cellula. Questo approccio perfeziona le attuali tecniche di imaging dal vivo e fornisce un'alternativa all'imaging intravitale.
Il mantenimento a lungo termine del tessuto utilizzando questa tecnica si basa sulla coltura di fette all'interfaccia aria-liquido. I precedenti modelli di espianto26,41 hanno probabilmente raggiunto una coltura di successo solo per pochi giorni perché sono stati immersi nei terreni ed essenzialmente "soffocati". Al contrario, l'uso di un sistema di coltura di interfaccia aria-liquido mantiene la salute e la struttura dei tessuti per un periodo prolungato, garantendo un imaging di alta qualità. Il metodo di montaggio delle fette di SMG prima dell'imaging, con una piccola quantità di terreno e all'interno di una camera a spazio limitato per mantenere la fetta piatta, è parte integrante del successo della tecnica. La visualizzazione delle cellule in questo test dipende da topi reporter marcati endogenamente o da anticorpi coniugati con fluorescenza. L'abbondanza di modelli murini reporter fluorescenti transgenici e di anticorpi coniugati mirati a specifici tipi e sottoinsiemi di cellule rende questo metodo adatto per esplorare varie interazioni cellulo-specifiche.
Sebbene questo metodo fornisca un buon modello di tessuto in situ e la lesione da irradiazione ex vivo provoca atrofia acinare e duttale, simile a quanto avviene in vivo13, alcuni elementi non possono essere ricapitolati ex vivo. Questi includono la mancanza di funzioni vascolari e di input neuronali, nonché l'assenza di cellule infiammatorie infiltranti. Dato il ruolo ben documentato dei vasi sanguigni e dei nervi nell'omeostasi e nella rigenerazione delle ghiandole salivari26,42 e l'importanza delle cellule immunitarie migratorie43, come le cellule T e B, nella funzione delle ghiandole salivari, nella risposta alle lesioni, nell'infezione e nella patogenesi della sindrome di Sjögren (SS) (come esaminato in44), questo test potrebbe perdere alcune importanti interazioni cellulari. Inoltre, gli eventi migratori molto veloci, come il movimento della cellula Natural Killer (NK)45 e della cellula dendritica (DC)46, possono essere persi dall'imaging ogni 15 minuti. Tuttavia, gli intervalli di imaging possono essere ottimizzati per studiare le specifiche interazioni cellula-cellula di interesse e la capacità di visualizzare immagini in 3 dimensioni attraverso z-stack consente la valutazione del movimento cellulare 3D. Il montaggio sicuro del tessuto durante l'imaging è fondamentale per la quantificazione, come le misurazioni di tracciamento cellulare. Inoltre, sebbene questo studio abbia utilizzato tessuto di topo, il protocollo fornisce un metodo praticabile per studiare le interazioni cellula-cellula nelle ghiandole salivari umane, generando preziose informazioni traduzionali irraggiungibili con altri metodi.
Mentre il ruolo dei macrofagi residenti nei tessuti nell'omeostasi e nella rigenerazione è stato dimostrato in diversi tessuti 2,10,11,12, il loro ruolo nelle ghiandole salivari rimane in gran parte senza risposta. Sebbene sia noto che i macrofagi sono essenziali per la rigenerazione epiteliale dopo una lesione da irradiazione13, i meccanismi precisi alla base di questo effetto rimangono sconosciuti. L'imaging dal vivo delle fette delle ghiandole salivari consente la visualizzazione e l'analisi in tempo reale di dinamiche tissutali complesse, che spesso sfuggono all'imaging confocale tradizionale. Inoltre, è evidente che i macrofagi subiscono cambiamenti dinamici nella forma mentre svolgono varie funzioni in vivo 47,48,49, e questo protocollo probabilmente fornisce una migliore rappresentazione di questi cambiamenti rispetto a una tipica visione statica nel tessuto fisso. Studi futuri possono utilizzare questa tecnica per studiare come cambia la comunicazione cellula-cellula nel corso dell'omeostasi, della lesione e della rigenerazione/risoluzione. Questo approccio sarà utile per chiarire le principali vie di segnalazione ed eventi che possono in ultima analisi offrire benefici terapeutici.

È stato dimostrato che i macrofagi svolgono ruoli sempre più importanti nei processi di rigenerazione e riparazione, estendendosi oltre la loro classica funzione immunitaria 1,2. Infatti, i macrofagi sono coinvolti in una pletora di processi legati alla rigenerazione, esibendo un'attività regolatoria critica in tutte le fasi della riparazione, così come la formazione di cicatrici e la fibrosi 3,4. I macrofagi residenti nei tessuti sono tipi di cellule altamente eterogenee con meccanismi complessi che guidano diversi fenotipi cellulari e svolgono ruoli essenziali nello sviluppo, nella funzione e nell'omeostasi degli organi (come esaminato in5). I macrofagi residenti nei tessuti originano inizialmente da precursori nel sacco vitellino e nel fegato fetale, e vengono successivamente sostituiti dalla proliferazione o dai monociti del sangue derivati dal midollo osseo a velocità variabili, a seconda della longevità dei macrofagi esistenti e del tessuto o della nicchia all'interno della quale risiedono 6,7.
È importante sottolineare che i macrofagi residenti nei tessuti sono dispersi in tutti i tessuti e contribuiscono a diverse funzioni degli organi. Sono programmati in modo univoco dal loro microambiente per svolgere funzioni specifiche di nicchia. Per questo motivo, la localizzazione dei macrofagi all'interno del tessuto offre informazioni sulla loro funzione, con popolazioni uniche osservate nel polmone, nella ghiandola mammaria, nell'intestino, nella pelle e nei muscoli 8,9,10. Durante lo sviluppo della ghiandola mammaria, i macrofagi duttali sono intimamente associati all'albero duttale e la loro deplezione si traduce in una significativa riduzione della ramificazione11. Inoltre, i macrofagi sono necessari per la morfogenesi durante la pubertà e l'alveologenesi in gravidanza, dove monitorano attivamente l'epitelio. Nella lesione muscolare, una specifica popolazione di macrofagi "dimora" all'interno del sito della lesione, fornendo una nicchia transitoria in cui forniscono segnali indotti dalla proliferazione necessari per la proliferazione delle cellule staminali. Pertanto, mostrano il ruolo specializzato di distinte popolazioni di macrofagi nel governare il processo di riparazione2. Nel polmone, un fenomeno simile si verifica quando i macrofagi interstiziali innescano cellule alveolari di tipo II (AT2) che esprimono interleuchina (IL)-R1 per la conversione in progenitori transitori associati al danno attraverso il rilascio diIL-1B 12. Inoltre, recenti ricerche hanno dimostrato che i macrofagi sono essenziali per la rigenerazione della ghiandola salivare sottomandibolare del topo (SMG) dopo una lesione da irradiazione e, in loro assenza, la rigenerazione epiteliale viene interrotta13. Nel loro insieme, questi dati evidenziano l'importanza dell'attivazione e della funzione dei macrofagi nelle nicchie infiammatorie transitorie dopo una lesione tissutale, così come durante l'omeostasi.
I macrofagi sono cellule attive e le loro funzioni coinvolgono interazioni con una varietà di diversi tipi di cellule, tra cui il contatto diretto cellula-cellula14,15, nonché metodi più indiretti come la secrezione di fattori solubili 2,16, che sono essenziali per la regolazione di nicchia. Mentre l'imaging immunofluorescente classico è utile per iniziare a svelare queste interazioni, è limitato dalla rappresentazione di una singola istantanea nel tempo, omettendo così numerosi punti temporali critici per un processo rigenerativo altamente dinamico17,18. Man mano che l'importanza del tempismo e l'emergere di diverse ondate di rigenerazione vengono messe a fuoco in modo più nitido, è essenziale sezionare questi processi in modo più dettagliato.
La radioterapia è un trattamento salvavita per molte persone a cui è stato diagnosticato il cancro. Sebbene sia spesso efficace nel ridurre o eliminare il tumore o i tumori, la radioterapia può anche danneggiare i tessuti sani che si trovano nel campo di radiazioni e suscitare una risposta immunitaria. Il danno da radiazioni può indurre un rapido reclutamento di macrofagi e risposte immunomodulatorie dirette e indirette19,20. Le ghiandole salivari vengono spesso inavvertitamente irradiate durante il trattamento per il cancro della testa e del collo21,22, portando a danno epiteliale, atrofia cellulare e fibrosi23,24, con conseguente xerostomia o secchezza cronica delle fauci25.
La ghiandola salivare è composta da una pletora di tipi e strutture cellulari, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, cellule epiteliali (sia cellule acinose che producono saliva che cellule duttali che trasportano la saliva), cellule mioepiteliali, cellule progenitrici epiteliali, nervi, vasi sanguigni, cellule immunitarie, fibroblasti e matrice extracellulare (ECM). Il ruolo e la risposta di molti di questi tipi cellulari nella risposta rigenerativa sono stati precedentemente descritti 26,27,28,29,30. Tuttavia, il modo in cui queste diverse cellule interagiscono durante l'omeostasi e la rigenerazione, e in particolare come si comportano le cellule immunitarie come i macrofagi, è meno studiato. Questo manoscritto descrive un metodo di recente istituzione per studiare le interazioni vive tra i macrofagi SMG e altre cellule di interesse nei tessuti ex vivo. L'SMG viene affettato su un vibratomo, colorato per i marcatori di superficie e ripreso per un massimo di 12 ore. Utilizzando questo metodo, è possibile osservare la fagocitosi delle cellule circostanti da parte dei macrofagi, studiare la cinetica di migrazione dei macrofagi e dimostrare le interazioni dirette cellula-cellula tra macrofagi e cellule epiteliali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m filter cell culture inserts (Nunc)</td>
			<td>Avantor/VWR</td>
			<td>734-2240</td>
			<td>Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm &#215; 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>111650</td>
			<td>Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided sticker</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654004</td>
			<td>SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Scientific Laboratories Supplies</td>
			<td>CHE1924</td>
			<td>Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-4801-82</td>
			<td>F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91113-10</td>
			<td>Student Fine Forceps Straight Broad Shanks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 6 well plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td>6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td>+calcium +magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td>Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11339623</td>
			<td>Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging and analysis software</td>
			<td>Harmony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Agarose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>&#160;A9414-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 &#956;m filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Gibco Advanced DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Disposable scalpels, No. 11 blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Extra Narrow Scissors 10.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator</td>
			<td>JL Shepherd &#38; Associates</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td>Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica VT 1000 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome blades</td>
			<td>Astra</td>
			<td></td>
			<td>Superior Platinum Double Edge blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type (C57BL/BJ) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interrogating cell-cell interactions in the salivary gland via ex vivo live cell imaging

La rigenerazione delle ghiandole salivari è un processo complesso che coinvolge intricate interazioni tra vari tipi di cellule. Studi recenti hanno fatto luce sul ruolo fondamentale svolto dai macrofagi nel guidare la risposta rigenerativa. Tuttavia, la nostra comprensione di questo ruolo critico si è basata principalmente su viste statiche ottenute da biopsie tissutali fisse. Per superare questa limitazione e ottenere informazioni su queste interazioni in tempo reale, questo studio delinea un protocollo completo per la coltura del tessuto delle ghiandole salivari ex vivo e l'acquisizione di immagini dal vivo della migrazione cellulare.
Il protocollo prevede diversi passaggi chiave: in primo luogo, il tessuto sottomandibolare delle ghiandole salivari del topo viene accuratamente affettato utilizzando un vibratomo e quindi coltivato in un'interfaccia aria-liquido. Queste fette possono essere danneggiate intenzionalmente, ad esempio, attraverso l'esposizione alle radiazioni, per indurre danni cellulari e innescare la risposta rigenerativa. Per tenere traccia di cellule specifiche di interesse, possono essere marcate endogenamente, ad esempio utilizzando il tessuto delle ghiandole salivari raccolto da topi geneticamente modificati in cui una particolare proteina è contrassegnata con una proteina fluorescente verde (GFP). In alternativa, gli anticorpi coniugati con fluorescenza possono essere impiegati per colorare le cellule che esprimono specifici marcatori di interesse sulla superficie cellulare. Una volta preparate, le fette di ghiandola salivare vengono sottoposte a imaging dal vivo utilizzando un sistema di imaging confocale ad alto contenuto per una durata di 12 ore, con immagini catturate a intervalli di 15 minuti. Le immagini risultanti vengono quindi compilate per creare un filmato, che può essere successivamente analizzato per estrarre preziosi parametri di comportamento cellulare. Questo metodo innovativo fornisce ai ricercatori un potente strumento per studiare e comprendere meglio le interazioni dei macrofagi all'interno della ghiandola salivare a seguito di una lesione, facendo così progredire la nostra conoscenza dei processi rigenerativi in gioco in questo contesto biologico dinamico.

Macrophages have been shown to play increasingly important roles in the processes of regeneration and repair, extending beyond their classical immune function1,2. Indeed, macrophages are involved in a plethora of processes related to regeneration, exhibiting critical regulatory activity in all stages of repair, as well as scar formation and fibrosis3,4. Tissue-resident macrophages are highly heterogeneous cell types with complex mechanisms driving diverse cellular phenotypes, and they play essential roles in organ development, function, and homeostasis (as reviewed in5). Tissue-resident macrophages initially arise from precursors in the yolk sac and fetal liver, and they are subsequently replaced by proliferation or by bone marrow-derived blood monocytes at varying rates, depending on the longevity of existing macrophages and the tissue or niche within which they reside6,7.
Importantly, tissue-resident macrophages are dispersed throughout all tissues and contribute to diverse organ functions. They are uniquely programmed by their microenvironment to perform niche-specific functions. For this reason, the localization of macrophages within the tissue offers insight into their function, with unique populations observed in the lung, mammary gland, intestine, skin, and muscle8,9,10. During mammary gland development, ductal macrophages are intimately associated with the ductal tree, and their depletion results in significantly reduced branching11. Furthermore, macrophages are required for morphogenesis during puberty and alveologenesis in pregnancy, where they actively monitor the epithelium. In muscle injury, a specific population of macrophages &#34;dwells&#34; within the injury site, providing a transient niche in which they supply proliferation-induced cues required for stem cell proliferation. Thus, they exhibit the specialized role of distinct macrophage populations in governing the repair process2. In the lung, a similar phenomenon occurs where interstitial macrophages prime interleukin (IL)-R1-expressing alveolar type II (AT2) cells for conversion into damage-associated transient progenitors through the release of IL-1B12. Furthermore, recent research has shown that macrophages are essential for the regeneration of the mouse submandibular salivary gland (SMG) after irradiation injury, and in their absence, epithelial regeneration is disrupted13. Taken together, this data highlights the importance of macrophage activation and function in transient inflammatory niches after tissue injury, as well as during homeostasis.
Macrophages are active cells, and their functions involve interactions with a variety of different cell types, including direct cell-cell contact14,15, as well as more indirect methods such as the secretion of soluble factors2,16, which are essential for niche regulation. While classical immunofluorescent imaging is useful to begin unraveling these interactions, it is limited by depicting only a single snapshot in time, thereby omitting numerous timepoints critical to a highly dynamic regenerative process17,18. As the importance of timing and the emergence of different waves of regeneration come into sharper focus, it is essential to dissect these processes in greater detail.
Radiotherapy is a life-saving treatment for many people diagnosed with cancer. While often effective at shrinking or eliminating the tumor(s), radiotherapy can also damage healthy tissues lying in the radiation field and elicit an immune response. Radiation injury can induce rapid macrophage recruitment, and direct and indirect immunomodulatory responses19,20. The salivary glands are often inadvertently irradiated during treatment for head and neck cancer21,22, leading to epithelial damage, cell atrophy, and fibrosis23,24, resulting in xerostomia or chronic dry mouth25.
The salivary gland is composed of a plethora of cell types and structures, including but not limited to epithelial cells (both saliva-producing acinar cells and saliva-transporting ductal cells), myoepithelial cells, epithelial progenitor cells, nerves, blood vessels, immune cells, fibroblasts, and extracellular matrix (ECM). The role and response of many of these cell types in the regenerative response have been previously described26,27,28,29,30. However, how these different cells interact during homeostasis and regeneration, and particularly how immune cells such as macrophages behave, is less well studied. This manuscript describes a newly established method to study the live interactions between SMG macrophages and other cells of interest in ex vivo tissue. The SMG is sliced on a vibratome, stained for surface markers, and imaged for up to 12 h. Using this method, phagocytosis of surrounding cells by macrophages can be observed, macrophage migration kinetics can be studied, and direct cell-cell interactions between macrophages and epithelial cells can be demonstrated.

Autore in primo piano: Studio delle interazioni tra macrofagi e cellule epiteliali nella rigenerazione delle ghiandole salivari dopo un infortunio 

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

My research delves into the immune system's role in regeneration and repair. I focus on understanding how macrophages interact with epithelial progenitor cells during salivary gland regeneration injury, and how this interaction shapes the repair process. Within the fields of immunology and regenerative medicine, recent clinical trials based at the University of Edinburgh have shown that delivery of macrophages as a therapy for liver psoriasis is effective in reducing liver scarring, and is a viable treatment for liver failure.Using and ex vivo precision cut slice culture model coupled with live imaging of fluorescent-labeled cells, allows us to explore cell-to-cell interactions in real-time, but in a state that closely resembles tissue in vivo. Understanding the localization of macrophages after injury gives us an idea of what cell types macrophages preferentially interact with after injury. This ultimately allows us to use other methods, such as single-cell RNA sequencing analysis, to try and unravel the molecular basis of such interactions to inform future therapeutic options.We will explore the bidirectional signaling between macrophages and epithelial cells and test whether saliva gland homeostasis can be rescued by exogenous replacement of these missing signals.

La risposta dei macrofagi alla lesione nella ghiandola salivare sottomandibolare rimane sconosciuta. Ciò include se si localizzano e migrano verso strutture specifiche all'interno della ghiandola, nonché la distanza e la velocità con cui migrano. Questo è stato difficile da determinare attraverso approcci di imaging statico.
Per affrontare questo problema, è stato sviluppato un approccio di imaging dal vivo per studiare l'interazione tra macrofagi e cellule epiteliali in tempo reale. La colorazione immunofluorescente delle fette è stata combinata con un modello murino di tracciamento del lignaggio marcato endogenamente (Figura 1A e Figura 2A). In questo modello, le fette sono state esposte a 10 Gy di irradiazione gamma per indurre lesioni da irradiazione e sono state visualizzate a 2 ore, 3 giorni e 4 giorni dopo l'irradiazione (IR), con fette non irradiate che fungevano da controlli. I dati sono stati acquisiti da quattro canali: Hoechst (utilizzando il laser 425 per ridurre al minimo la fototossicità), GFP (488), dTomato (561) e Alexa 647 (640). È stata eseguita una z-stack e un'immagine è stata catturata ogni 2-3 μm, con un totale di 30-40 piani raccolti, ottenendo un'altezza complessiva di 80-90 μm.
Utilizzando questa tecnica e analizzando il segnale di pomodoro legato alla membrana (mT) e l'attività della caspasi3/7, è diventato evidente che le fette organotipiche hanno mantenuto la loro struttura epiteliale, sono sopravvissute in coltura e hanno mostrato una morte cellulare minima. I dati hanno mostrato che le fette non irradiate della ghiandola sottomandibolare di topi R26 mTmG 32, coltivate per 7 giorni, hanno mantenuto il segnale mT e l'architettura epiteliale (Figura 1B). Tuttavia, a 3 giorni dall'irradiazione ex vivo, l'atrofia delle cellule acini e duttali era evidente (Figura 1B; strutture acini e duttali evidenziate rispettivamente da linee bianche e verdi tratteggiate), coerente con il danno da radiazioni in vivo 13. L'apoptosi è risultata trascurabile nelle fette non irradiate, ma c'è stata evidenza di cellule di Caspasi 3/7+ nelle fette irradiate a 4 giorni dopo l'irradiazione (Figura 1C; frecce verdi), simile alla lesione in vivo 33,34. Inoltre, le fette irradiate hanno ricapitolato in vivo il danno al DNA 34,35,36,37, come indicato da un elevato γH2AX38 rispetto ai controlli non irradiati (Figura 1D,E). Pertanto, le fette organotipiche delle ghiandole salivari hanno mostrato una buona vitalità in coltura e hanno risposto in modo simile al tessuto in vivo all'irradiazione.
Successivamente, sono state studiate le interazioni cellula-cellula in tempo reale. I macrofagi che interagiscono direttamente con le cellule progenitrici epiteliali marcate con GFP (Krt14CreER-GFP) sono stati osservati per un periodo di tempo di 12 ore a 3 giorni dopo l'IR (Figura 2A e Video 1). Sorprendentemente, era evidente che i macrofagi rimanevano in prossimità delle cellule progenitrici epiteliali per ore, spesso rimanendo in contatto per l'intero periodo di imaging di 12 ore. Inoltre, è stata osservata la fagocitosi in tempo reale delle cellule epiteliali da parte dei macrofagi, confermando che i macrofagi svolgono la loro funzione tradizionale nel modello di coltura a fette (Figura 2B, Video 2 e Video 3). Questa tecnica ha anche identificato che i macrofagi sono relativamente stazionari sia durante l'omeostasi che dopo il danno da irradiazione, probabilmente a causa della loro alta densità all'interno del tessuto. Ciò dimostra, per la prima volta, che i macrofagi delle ghiandole salivari non migrano estensivamente durante l'omeostasi o dopo una lesione da irradiazione. Tuttavia, mentre i macrofagi non hanno mostrato una migrazione significativa, il tessuto circostante ha mostrato una maggiore dinamica dopo l'irradiazione, con più macrofagi che interagiscono attivamente attorno a gruppi di cellule epiteliali marcate. Inoltre, basata esclusivamente sulla colorazione nucleare, questa tecnica ci ha permesso di visualizzare il movimento delle cellule all'interno della fetta nel tempo, spesso con interi dotti che sembrano "migrare" all'interno del tessuto (Video 4). Nel corso del tempo, durante il processo di coltura, è diventato evidente che le fette si sono spostate da una morfologia piatta a una sferoide, suggerendo che il movimento delle cellule all'interno della fetta è probabilmente dovuto al loro riarrangiamento in una struttura simile a una sfera, simile a un potenziale evento di riorganizzazione.
Infine, i dati di imaging in tempo reale generati da questo test possono essere utilizzati per misurare quantitativamente il comportamento cellulare, come la migrazione. Le singole cellule possono essere rilevate e segmentate (Figura 3A) e la migrazione può essere misurata utilizzando un software di imaging e analisi disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali e il video 5). Inoltre, è possibile effettuare l'analisi degli oggetti più vicini per determinare se le cellule, in questo caso i macrofagi, migrano più vicino ad altre cellule di interesse, in questo caso le cellule Krt14 CreER-GFP+, e come questa dinamica cambia nel tempo (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65819/65819fig1.jpg"> Figura 1: Ricapitolazione della risposta in vivo in fette di tessuto delle ghiandole salivari tagliate con precisione. (A) Schema del protocollo sperimentale. (B) Immagini rappresentative di pomodoro legato alla membrana ottenuto da tessuto fresco di ghiandola sottomandibolare (SMG), fette di SMG non manipolate coltivate per 7 giorni o fette di SMG irradiate con una singola dose di irradiazione gamma a 10 Gy 3 o 7 giorni prima. Le linee bianche tratteggiate indicano esempi di strutture acinose e le linee verdi tratteggiate indicano esempi di strutture duttali. Barra della scala = 50 μm. (C) Immagini rappresentative dell'espressione della caspasi-3/7 ottenute da fette di SMG non manipolate o da fette di SMG irradiate con una singola dose di irradiazione gamma a 10 Gy 2 ore o 4 giorni prima. Le punte di freccia verdi indicano nuclei positivi. Barra della scala = 50 μm. (D) Immagini rappresentative dell'espressione di γH2AX ottenute da fette di SMG non manipolate o da fette di SMG irradiate con una singola dose di irradiazione gamma da 10 Gy 3 giorni prima. Barra della scala = 20 μm. (E) Espressione rappresentativa di γH2AX in cellule epiteliali EpCAM+ da fette di SMG non manipolate o da fette di SMG irradiate con una singola dose di irradiazione gamma a 10 Gy 2 ore e 3 giorni prima. SSA = area di dispersione laterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/65819fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65819/65819fig2.jpg"> Figura 2: Imaging dal vivo delle interazioni macrofagi-cellule epiteliali e della fagocitosi. (A) Immagini fisse sequenziali delle interazioni tra le cellule progenitrici KRT14+ e la loro progenie (cellule Krt14 CreER-GFP+) e i macrofagi dopo l'irradiazione. L'imaging di cellule vive cattura le dinamiche cellulari per un periodo di 90 minuti. Barra della scala = 20 μm. Il video associato è il video 1. (B) Immagini fisse sequenziali di un macrofago fagocita una cellula epiteliale. L'imaging di cellule vive mostra il processo in un periodo di 60 minuti. Le frecce bianche indicano il macrofago e le frecce gialle indicano il nucleo della cellula in fase di fagocitosi. Barra graduata = 50 μm. Il video associato è il video 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/65819fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65819/65819fig3.jpg"> Figura 3: Imaging dal vivo per l'analisi della dinamica cellulare. (A) Immagine che illustra l'identificazione e la segmentazione delle singole cellule per l'analisi dei parametri di comportamento cellulare, come la migrazione (vedi Video 5). Le cellule sono pseudocolorate in modo casuale per la distinzione delle singole cellule e delle tracce. Barra della scala = 100 μm. (B) Quantificazione della distanza (in μm) dell'oggetto più vicino alle singole celle Krt14 CreER-GFP+ tracciate su 10 punti temporali (immagini catturate ogni 5 minuti). Dati presentati come valore medio per pozzetto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/65819fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video 1: Imaging dal vivo che rivela le interazioni dinamiche tra le cellule progenitrici di KRT14+ e i macrofagi dopo l'irradiazione. Le fette sono state esposte a una singola dose di irradiazione gamma di 10 Gy prima dell'imaging dal vivo. Le celluleKrt14 CreER-GFP+ sono rappresentate in verde, i macrofagi (F4/80+) in rosso e i nuclei in ciano. Il video comprende un singolo z-stack, che copre un periodo di coltura di 12 ore con immagini catturate ogni 15 minuti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20et%20al_Video%201.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare il video.</a>
Video 2: Imaging dal vivo che cattura un macrofago che inghiotte una cellula epiteliale. I macrofagi (F4/80+) sono raffigurati in rosso e i nuclei sono mostrati in ciano. Il video è costituito da un singolo z-stack e copre un periodo di coltura di 12 ore con immagini scattate ogni 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20et%20al_Video%202.wmv" target="_blank">minuti.</a>
Video 3: Immagine dal vivo a proiezione massima che mostra un macrofago che inghiotte una cellula epiteliale. I macrofagi (F4/80+) sono visualizzati in rosso e i nuclei sono mostrati in ciano. Il video presenta una proiezione massima di immagini z-stack per un totale di 80 μm (un singolo piano è presentato nel Video 2) e copre un periodo di coltura di 12 ore con immagini scattate ogni 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20at%20al_Video%203.wmv" target="_blank">minuti.</a>
Video 4: Immagini dal vivo che illustrano il comportamento dinamico dell'epitelio delle ghiandole salivari in coltura dopo irradiazione. Le fette sono state sottoposte a una singola dose di irradiazione gamma di 10 Gy prima dell'imaging dal vivo. I macrofagi (F4/80+) sono rappresentati in rosso, i nuclei in ciano. Il video comprende un singolo z-stack, che copre un periodo di coltura di 12 ore con immagini catturate ogni 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20et%20al_Video%204.wmv" target="_blank">minuti.</a>
Video 5: Monitoraggio quantitativo della migrazione cellulare nel tempo. Questo video mostra il tracciamento individuale delle tracce cellulari dai video di imaging dal vivo. Le frecce indicano le tracce delle celle e le celle sono pseudo-colorate individualmente. Il video è costituito da un singolo z-stack e copre un periodo di coltura di 1 ora con immagini scattate ogni 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20at%20al_Video%205.wmv" target="_blank">minuti.</a>

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L'imaging immunofluorescente è limitato dalla capacità di osservare processi biologici complessi e dipendenti dal tempo in una singola istantanea nel tempo. Questo studio delinea un approccio di imaging dal vivo condotto su fette di ghiandola sottomandibolare di topo tagliate con precisione. Questo approccio consente l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellula-cellula durante l'omeostasi e i processi di rigenerazione e riparazione.

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

La mia ricerca approfondisce il ruolo del sistema immunitario nella rigenerazione e nella riparazione. Mi concentro sulla comprensione di come i macrofagi interagiscono con le cellule progenitrici epiteliali durante la lesione da rigenerazione delle ghiandole salivari e di come questa interazione modella il processo di riparazione. Nell'ambito dell'immunologia e della medicina rigenerativa, recenti studi clinici condotti presso l'Università di Edimburgo hanno dimostrato che la somministrazione di macrofagi come terapia per la psoriasi epatica è efficace nel ridurre le cicatrici epatiche ed è un valido trattamento per l'insufficienza epatica.L'utilizzo di un modello di coltura a fette tagliate di precisione ex vivo, abbinato all'imaging dal vivo di cellule marcate con fluorescenza, ci consente di esplorare le interazioni cellula-cellula in tempo reale, ma in uno stato che assomiglia molto al tessuto in vivo. Comprendere la localizzazione dei macrofagi dopo una lesione ci dà un'idea di quali tipi di cellule i macrofagi interagiscono preferenzialmente dopo la lesione. Questo ci permette di utilizzare altri metodi, come l'analisi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula, per cercare di svelare le basi molecolari di tali interazioni per informare le future opzioni terapeutiche.Esploreremo la segnalazione bidirezionale tra macrofagi e cellule epiteliali e verificheremo se l'omeostasi delle ghiandole salivari può essere salvata dalla sostituzione esogena di questi segnali mancanti.

interrogating-cell-cell-interactions-salivary-gland-via-ex-vivo-live

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

891 Views.  The University of Edinburgh. La mia ricerca approfondisce il ruolo del sistema immunitario nella rigenerazione e nella riparazione. Mi concentro sulla comprensione di come i macrofagi interagiscono con le cellule progenitrici epiteliali durante la lesione da rigenerazione delle ghiandole salivari e di come questa interazione modella il processo di riparazione. Nell'ambito dell'immunologia e della medicina rigenerativa, recenti studi clinici condotti presso l'Università di Edimburgo hanno dimostrato che la somministrazio...

Video: Autore in primo piano: Studio delle interazioni tra macrofagi e cellule epiteliali nella rigenerazione delle ghiandole salivari dopo un infortunio 

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Ricerca

Immunologia e infezioni

Collection, Embedding, Sectioning, and Staining of the Mouse Submandibular Salivary Gland for Live Cell Imaging of Cell-Cell Interactions

To begin, use forceps to remove any fat and connective tissue from the dissected submandibular salivary gland of a euthanized mouse. Then place the gland in a collection tube with ice cold HBSS solution. Next, use forceps to cut the gland into one centimeter square pieces.Heat 4%agarose to 50 degrees Celsius, and pour the solution into a 35 millimeter dish. Pour a small amount of the agarose solution into a separate dish and add the gland pieces into it. Then swirl the pieces in the excess agarose to coat it.Next place four to six pieces of the gland flat in the first dish with agarose. Place the lid on the dish and transfer it to an ice box, covering the plate with ice to cool and set. To section the gland pieces, first, use a scalpel to carefully cut around the gland embedded agarose block.Next, apply a drop of super glue to the agarose block and attach it to the stage of a vibratome. Now fill the vibratome chamber with ice cold PBS containing 1%penicillin streptomycin. With a scalpel, trim off any excess agarose and create five millimeter gaps between each piece of gland.Align the vibratome blade with the agarose block and set the start and end points of the sections. Cut the tissue block into 150 micrometer thick sections at a low speed and high vibration. Once the sections have been cut, use a paintbrush to pick up the slices and place them in a dish with prewarmed RPMI media containing the antibiotics.To culture the submandibular slices, first, add 1.5 milliliters of RPMI media to the wells of a six well plate. Place 0.4 micrometer filters into the wells. Next, with the help of a paintbrush, carefully transfer one to six slices onto each filter.Then incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide. After irradiating some experimental plates with gamma radiation to induce injury, return the plates to the incubator. Next, fill the wells of a 24 well plate with 500 microliters of culture media.With a paintbrush, lift the slices from the filter and gently submerge them in the wells. Incubate the slices in the relevant nuclear stains. Then incubate the slices with antibodies for two hours at 37 degrees Celsius under gentle agitation.Submerge the slices in culture media three times to wash them. Let the slices incubate in each wash solution for 10 minutes at room temperature under gentle agitation. Next, use forceps to remove the tape from a double-sided imaging spacer.Stick the spacer to the bottom of a glass-bottomed six well plate, then pipette 50 microliters of media into the gap in the center of the spacer. Place the slice into the media ensuring it lays flat. Then with a pipette, carefully remove 20 microliters of the media from the gap.Use forceps to carefully remove the tape from the top side of the spacer and place a 25 millimeter circular cover slip over it. Press around the spacer edges to ensure firm attachment of the cover slip. Image the slice on a confocal microscope.Non-irradiated slices of the submandibular gland cultured for seven days retained their MT signal and epithelial architecture. However, at three days post-irradiation, acinar and ductal cell atrophy was observed. Caspase positive cells were seen at four days post-irradiation.Elevated gamma H2AX was observed in irradiated slices, indicative of in vivo DNA damage. Realtime imaging of macrophages confirmed phagocytosis of epithelial cells in the slice culture model. Individual cells can be detected and segmented for subsequent analysis of cell behavior, such as migration.

Raccolta, inclusione, sezionamento e colorazione della ghiandola salivare sottomandibolare di topo per l'imaging di cellule vive delle interazioni cellula-cellula