Per iniziare, preparare campioni di tessuto renale chiaro. Quindi accendere il microscopio confocale attivando prima l'alimentazione laser e poi inserendo l'interruttore di controllo confocale. Quindi, avviare il computer, accendere il microscopio e avviare l'hardware confocale.
Dopo aver eseguito l'autotest, avviare il software confocale. Selezionare l'obiettivo appropriato. Prelevare il campione dal reagente R cubico e posizionarlo nella capsula confocale.
Coprirlo per evitare che il reagente R cubico si asciughi. Spostare il campione al centro del campo visivo e regolare la messa a fuoco fino a quando il campione non è a fuoco. Per la ricostruzione 3D, regolare il piano dello zoom in una direzione fino a quando non è visibile alcuna fluorescenza, definendo questa posizione come superiore.
Quindi regolare il piano dello zoom nella direzione opposta fino a quando non è visibile alcuna fluorescenza, definendo questa posizione come inferiore. Fare clic sul pulsante Esegui nell'angolo in basso a destra della finestra di dialogo per avviare la scansione. Per la ricostruzione di immagini di grandi dimensioni, posizionare il campo visivo al centro del campione e stabilirlo come centro.
Scegli un campo visivo a due a due. Nell'interfaccia multifunzione ND, selezionare lo stack Z per ricostruire immagini di grandi dimensioni. Regolare le varie opzioni nel pannello in base alle esigenze e premere il pulsante Esegui per iniziare la scansione.
Far aderire il rene trasparente all'adattatore di fissaggio del campione con la colla e attendere che il rene sia fissato saldamente. Quindi immergere il rene nel contenitore del campione e far scorrere il contenitore del campione nel sistema del microscopio. Sigillare il portello.
Nell'interfaccia di localizzazione, regolare il campione in una posizione di osservazione appropriata. Passare all'interfaccia di acquisizione, impostare il percorso ottico. Selezionare il laser a 488 nanometri.
Scegliere il filtro del fascio di luce 405-488-561-640, quindi impostare il blocco del filtro di divisione ottica su SBS LP 490. Selezionare la seconda telecamera e modificare lo pseudo colore in verde. Immettere l'offset Z sinistro e poi destro ottenuto dal sottomenu del canale.
Selezionare lo zoom più piccolo e regolarlo con precisione per ottenere una nitidezza ottica. Identificare il contorno XY e l'intervallo Z per l'intero organo. Quindi modulare l'intensità del laser e il tempo di esposizione a meno di 10 millisecondi.
Avviare il processo facendo clic su Avvia esperimento. Se il tessuto è eccessivamente grande, combinare due o più immagini con lo stitching dell'immagine utilizzando il software di microscopia. Aprire il file acquisito e selezionare l'elaborazione.
Quindi metodo e stitching, seguiti dal parametro method. Fare clic su Applica per finalizzare l'unione dell'immagine. Il filamento fitindex iniettato per via intravascolare è stato utilizzato per l'etichettatura dei glomeruli.
Nel rene pulito, i glomeruli potevano essere chiaramente osservati utilizzando la microscopia a foglio ottico o la microscopia confocale.
