Per iniziare, prendiamo le sezioni cerebrali di paraffina di sei topi neri C57 iniettati con PFF. Decerare i vetrini immergendoli in un sostituto dello xilene e incubandoli per due minuti. Per la reidratazione, immergere i vetrini in etanolo al 100%, 95% e 70%, quindi due volte in acqua deionizzata.
Trasferire i campioni in un contenitore per microonde insieme a acqua bidistillata. Riscaldare il tampone citrato 100 volte con pH sei a quattro gradi Celsius. Quindi preparare 350 millilitri di tampone citrato fresco.
Versare il tampone citrato preparato in un contenitore di plastica con coperchio. Posizionare i vetrini nel contenitore del tampone citrato e chiudere il coperchio. Cuocere i campioni nel microonde a 700 watt per quattro minuti, quindi lasciare il tempo per un riposo di cinque minuti.
Cuocere nel microonde per altri 1,5 minuti, seguiti da un periodo di riposo di cinque minuti e reintegrare il tampone citrato. Cuocere nel microonde per 1,5 minuti e lasciare riposare per cinque minuti. Quindi raffreddare i campioni e il tampone citrato su ghiaccio per 20 minuti e lavarli con acqua bidistillata.
Asciugare i vetrini del campione utilizzando un tovagliolo di carta senza toccare il fazzoletto. Usando una penna, disegna dei rettangoli attorno ai pezzi di tessuto. Ora trasferisci tutti i vetrini in una scatola di colorazione immunitaria per vetrini.
Lavali delicatamente più volte con TBS-T assicurandoti che le gocce TBS-T rimangano all'interno dei rettangoli della penna PAP. Picchiettare i vetrini su un tovagliolo di carta per rimuovere TBS-T. Aggiungere 50 microlitri di blocco a ciascun rettangolo e incubare per un'ora a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, utilizzando un tovagliolo di carta, rimuovere la soluzione bloccante dai campioni. Pipettare delicatamente 50 microlitri della miscela di anticorpi primari e TBS-T in ciascun rettangolo e incubare i campioni per una notte a quattro gradi Celsius. Quindi lavare i vetrini con TBS-T.
Rimuovere il TBS-T picchiettando su un tovagliolo di carta. Ripeti questo processo tre volte. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di miscela di anticorpi secondari a una diluizione da uno a 1000 in TBS-T in ciascun rettangolo e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora al buio.
Successivamente, lavare il campione tre volte con TBS-T. Quindi incubare il campione con DAPI a una concentrazione di due microgrammi per millilitro in TBS-T per un minuto. Rimuovere la soluzione DAPI picchiettando su un tovagliolo di carta e lavare tre volte con TBS-T.
Per montare un vetrino, aggiungere ai campioni due gocce per vetrino di reagente di montaggio. Premere delicatamente il vetrino coprioggetto per eliminare le bolle e lasciare asciugare i campioni per un'ora a temperatura ambiente. Immagini di almeno 50 cellule in vari campi utilizzando un sistema di imaging a fluorescenza a illuminazione strutturata dotato di un obiettivo a olio 60 volte o di una tecnologia confocale.
Per analizzare le celle, isolare l'area di interesse disegnando un contorno attorno alla cella positiva o negativa e utilizzando la funzione di ritaglio. Successivamente, attivare i descrittori di forma e limitare le opzioni di soglia nella funzione di misurazione impostata. Regolare il livello di soglia selezionando la funzione di soglia nel menu di regolazione.
Infine, usa lo strumento Analizza particelle e imposta una dimensione appropriata per catturare i mitocondri. Ad esempio, impostare la dimensione su 25 infinito, quindi attivare le unità pixel e selezionare Mostra maschere"Vengono mostrati i nigra pars compacta sostanziali di topi iniettati PFF colorati con co-ammino per tirosina idrossilasi VDAC1, PS129 alfa-sinucleina e DAPI. La colorazione anti-sinucleina alfa-PS129 ha permesso di discriminare le cellule che ospitavano lesioni PS129 dalle cellule sane.
L'analisi delle immagini della colorazione con VDAC1 dei neuroni positivi alla tirosina idrossilasi ha rivelato una riduzione sia della conta del numero mitocondriale che del rapporto d'aspetto tra i neuroni portatori di lesioni PS129 e i neuroni che ne sono privi.
