Per iniziare, prendete un piatto di cellule HeLa di tipo selvatico e mutanti CENP-E che crescono su un vetrino coprioggetto. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% e soluzione fissativa PBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, immergiti nel PBS per due round di cinque minuti ciascuno.
Successivamente, permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,25% e PBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Immergili nel PBS per due giri di cinque minuti ciascuno. Procedere a bloccare le celle con 1%BSA PBS con 0,1%Tween 20 a temperatura ambiente per un'ora.
Diluire gli anticorpi primari in BSA e PBST all'1% e incubare i campioni a quattro gradi Celsius per 12 ore. Scartare le soluzioni anticorpali primarie. Quindi, sciacquare le celle tre volte per cinque minuti ciascuna con PBS.
Aggiungere anticorpi secondari diluiti alla cellula e incubare a temperatura ambiente per due ore. Successivamente, scartare gli anticorpi secondari. Quindi sciacquare le celle con PBS tre volte per cinque minuti ciascuna.
Colorare i nuclei con DAPI a temperatura ambiente per cinque minuti. Montare i vetrini con il mezzo di montaggio e sigillarli con lo smalto. Osservare le immagini a fluorescenza utilizzando un microscopio confocale a scansione, dotato di un ingrandimento di 63 volte, con un obiettivo numerico di apertura di 1,40 e registrarle per ulteriori analisi.
La colorazione in immunofluorescenza dei gruppi di controllo e mutanti CENP-E ha mostrato che le intensità di fluorescenza delle proteine CENP-E sono state completamente eliminate nelle cellule mutanti del clone 1 CENP-E e sono diminuite significativamente nelle cellule mutanti del clone 3 CENP-E. I rapporti delle cellule in metafase con disallineamento cromosomico sono aumentati nei cloni 1 e 3 rispetto alle cellule di controllo. Nel frattempo, i rapporti delle cellule in metafase sono aumentati significativamente nelle cellule del clone 1 e del clone 3.
Inoltre, il rapporto di cellule interfasiche è leggermente aumentato nei gruppi Clone 1 e 3 dopo la delezione di CENP-E, rispetto al gruppo di controllo. I tassi di cellule di profase, anafase e telofase sono leggermente diminuiti dopo la delezione di CENP-E, mentre i tassi di cellule in metafase sono aumentati dopo la delezione di CENP-E.
