Preparazione cromosomica e analisi del cariotipo di cellule HeLa knockout CENP-E mediate da CRISPR/Cas9

Per iniziare, prendi le colture cellulari HeLa wild type e mutanti CENP-E e aggiungi 300 colchicina nanomolare prima di incubarle per cinque ore. Successivamente, incubare le cellule con tripsina-EDTA allo 0,25% a 37 gradi Celsius per tre minuti e raccogliere le cellule in provette da centrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, centrifugare le cellule a 1000 G per cinque minuti a temperatura ambiente, scartare i surnatanti e aggiungere 1,2 millilitri di soluzione di cloruro di potassio 0,075 molari.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule, scartare il surnatante e aggiungere 0,2 millilitri di soluzione fissativa per il prefisso. Mescolare delicatamente per un minuto, quindi raccogliere i pellet cellulari come dimostrato in precedenza e aggiungere 1,5 millilitri di soluzione fissativa a temperatura ambiente per 10 minuti.

Dopo aver centrifugato le cellule e scartato il surnatante, aggiungere 0,6 millilitri di soluzioni fissative per creare una sospensione cellulare. Far cadere con cautela da tre a cinque goccioline delle sospensioni cellulari da 35 a 40 centimetri sugli scivoli di ghiaccio. Asciugare immediatamente i vetrini con una lampada ad alcool e colorarli con la soluzione di sostegno al 10% di Giemsa per sette minuti.

Sciacquare i vetrini con acqua corrente per due minuti, quindi esaminare i campioni utilizzando un microscopio ottico dotato di un obiettivo numerico Plan Fluor con ingrandimento 40x e apertura di 0,75. L'analisi del cariotipo ha rivelato una diminuzione del numero di cromosomi nelle cellule HeLa mutanti CENP-E rispetto alle cellule wild type.