Per iniziare, preparare il tampone 2X per RT-qPCR in acqua priva di DNasi/RNasi. Conservare il tampone a meno 20 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Quindi, mescolare i primer e le sonde in un tubo da 1,5 millilitri.
Aumentare il volume con il tampone di eluizione. Quindi conservare il tubo a meno 20 gradi Celsius. Preparare una miscela enzimatica con Taq polimerasi e M-MLV RT in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio.
Compensare il volume con il tampone di stoccaggio della Taq polimerasi. Ora ri-sospendi gli RNA sintetici virali in provette separate con 100 microlitri di tampone Tris-EDTA per fare scorte da 10 al sesto RNA copie per microlitro. Per mescolare le scorte di virus, aggiungere cinque microlitri ciascuno di SARS-CoV-2 influenza A e B a 50 microlitri di tampone Tris-EDTA.
Allo stesso modo, mescola SARS-CoV-2 e MERS-CoV per ottenere un secondo mix virale. Diluire entrambe le miscele dieci volte per ottenere una diluizione finale di 10 copie di RNA per microlitro. A ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, pipettare 2X tampone, primer, enzima, acqua priva di DNasi/RNasi e le corrispondenti miscele di RNA.
Sigillare la piastra con un sigillo adesivo per piastra. Quindi centrifugare la piastra per un minuto per raccogliere il liquido sul fondo del pozzo. Successivamente, programmare la macchina PCR in modo che accetti il tipo a blocco veloce a 96 pozzetti con il tipo sperimentale impostato sulla curva standard.
Impostare i reagenti su Reagenti TaqMan e selezionare le proprietà di esecuzione standard. Definire i bersagli genici e il colorante reporter. Quindi definire i nomi dei campioni per ogni reazione da testare e assegnare target e campioni al layout della piastra.
A questo punto, inserire il programma di ciclo nello strumento. Trasferire la piastra sulla macchina qPCR in tempo reale con l'orientamento corretto e premere RUN per avviare il ciclo. Scegliere il percorso del file in cui salvare i dati sperimentali.
Quindi esaminare i grafici di amplificazione forniti dal programma qPCR. I due kit sviluppati sono stati in grado di amplificare con successo tutti e tre i geni bersaglio simultaneamente con un minimo di 10 copie di RNA per reazione. L'efficienza di amplificazione per tutte le titolazioni virali è stata superiore al 99%
