1 Per iniziare, rimuovere i tessuti polmonari bovini congelati2 da 80 gradi Celsius 3 e lasciarli scongelare a temperatura ambiente. 4 Sezionare il tessuto utilizzando bisturi e forbici sterili 5 per rimuovere la trachea e le vie aeree cartilaginose, 6 quindi coniare il tessuto in piccoli pezzi. 7 Lavare il tessuto tre volte 8 con acqua ultrapura 9 contenente il 2% di penicillina e streptomicina.
10 Immergere il campione di tessuto tritato 11 in una soluzione di iodio al 2% per un minuto, 12 quindi eseguire due lavaggi consecutivi 13 in acqua distillata sterile. 14 Trasferire i pezzi di tessuto in una provetta da 50 millilitri 15 fino alla tacca di 15 millilitri. 16 Riempire la provetta fino in cima con acqua distillata 17 e congelarla in azoto liquido per due minuti.
18 Quindi trasferire immediatamente il tubo in un becher 19 contenente acqua a 37 gradi Celsius per 10 minuti. 20 Dopo cinque cicli di congelamento e disgelo, 21 incubare il campione in 30 millilitri 22 di soluzione di DNasi per un'ora 23 a 37 gradi Celsius con agitazione costante. 24 Congelare i campioni di matrice extracellulare decellularizzata umida 25 a 80 gradi Celsius per 24 ore.
26 Trasferire i campioni congelati in un liofilizzatore 27 e operare in modalità di essiccazione sotto vuoto 28 per tre o quattro giorni fino a completa asciugatura. 29 Dopo la liofilizzazione, 30 macinare i campioni fino a ottenere una polvere fine 31 in un apparecchio di macinazione contenente ghiaccio secco. 32 Trattare i tessuti polmonari con Triton-X-100 all'1% 33 per tre giorni sotto rotazione delicata 34 a quattro gradi Celsius, 35 cambiando la soluzione ogni 24 ore.
36 Incubare il campione nella soluzione di DNasi 37 per un'ora a 37 gradi Celsius agitando costantemente. 38 Lavare il fazzoletto con acqua distillata 39 per tre giorni in costante rotolamento, 40 reintegrando l'acqua ogni 24 ore. 41 Dopo l'ultimo lavaggio, eseguire la liofilizzazione e la criomacinazione 42 come dimostrato in precedenza.
43 Digerire 15 milligrammi per millilitro 44 campioni di matrice extracellulare decellularizzata in polvere 45 in un milligrammo per millilitro di soluzione di pepsina 46 a temperatura ambiente sotto agitazione costante per 48 ore. 47 Mantenere il pH della soluzione a due per una digestione efficace. 48 Centrifugare il digestato dei tessuti a 5.000 g per 10 minuti 49 e rimuovere il surnatante.
