Per iniziare, procurarsi una formula precedentemente preparata e un vetrino per campioni di tessuto di cancro al polmone fissato e incorporato in paraffina. Incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Eseguire la disidratazione immergendo il vetrino nello xilene, seguito da soluzioni di etanolo a concentrazioni decrescenti.
Quindi immergere i vetrini in acqua sterilizzata tre volte per un minuto ciascuno. Per il recupero dell'antigene, posizionare il vetrino in una scatola di colorazione e riparazione. Riempirlo con una soluzione di lavoro tampone di riparazione dell'antigene immunoistochimico a pH sei o nove.
Coprite la scatola con un coperchio e scaldatela in forno a microonde per otto minuti al 100% di potenza. Quindi raffreddare il vetrino a temperatura ambiente. Coprire il tessuto con una soluzione bloccante, quindi incubare in una camera umidificata a temperatura ambiente per 10 minuti.
Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, coprire il vetrino con la soluzione di lavoro dell'anticorpo primario e posizionarlo in una camera umidificata. Quindi incubare questa camera per un'ora a 37 gradi Celsius. Successivamente, lavare il vetrino con una soluzione di lavoro tampone di lavaggio per due minuti.
Aggiungere il polimero perossidasi di rafano direttamente goccia a goccia sul vetrino e incubarlo per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato il vetrino, aggiungere la soluzione di lavoro al fluoroforo direttamente goccia a goccia sul vetrino e incubarlo per 10 minuti a temperatura ambiente. Una volta lavato il vetrino, somministrare un trattamento a microonde come dimostrato in precedenza.
Quando il vetrino si è raffreddato a temperatura ambiente, lavarlo tre volte con acqua bidistillata per un minuto ciascuna. Quindi, immergere il vetrino nella soluzione di lavoro del tampone di lavaggio per due minuti ed eseguire l'incubazione degli anticorpi, la perossidasi di rafano e l'aggiunta di fluorofori come dimostrato. Per la colorazione nucleare cellulare, coprire il vetrino con la soluzione di lavoro DAPI e incubarlo in una camera umidificata per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi lavare i vetrini con acqua bidistillata tre volte, un minuto ciascuna. Rimuovere le gocce d'acqua dal vetrino. Aggiungere da 10 a 20 microlitri di quencher antifluorescenza al vetrino e sigillarlo con un vetro di copertura per microscopio.
