Gli autori desiderano ringraziare i membri del Clinical Pathology Research Institute West China Hospital, che hanno contribuito alla guida tecnica per l'immunofluorescenza multiplex di qualità e l'elaborazione IHC. Questo protocollo è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82200078).

Il protocollo è approvato dalle linee guida del Comitato Etico del West China Hospital, Sichuan University, Cina. I campioni di tessuto del cancro al polmone sono stati ottenuti durante l'intervento chirurgico nel Centro per il cancro al polmone presso l'ospedale della Cina occidentale ed è stato ottenuto il consenso informato da ciascun paziente.
1. Preparazione della sezione tissutale
<ol><li>Preparazione FFPE<ol><li>Immergere i tessuti clinici in una soluzione di formalina neutra per più di 72 ore.</li>
		<li>Completare il processo di disidratazione dei tessuti utilizzando xilene e soluzioni alcoliche classificate20.</li>
		<li>Eseguire l'inclusione manuale della paraffina e il sezionamento dei tessuti con uno spessore della sezione di 4 μm. Utilizzare vetrini per microscopio di adesione per assicurarsi che le fette di tessuto non cadano.</li>
		<li>Cuocere i vetrini in forno a 65 °C per 2 ore per assicurarsi che il tessuto e i vetrini siano asciutti. Conservare in una scatola per vetrini a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Pretrattamento della sezione tissutale<ol><li>Pretrattare i vetrini di tessuto in forno a 65 °C per 5 minuti, quindi immergerli in sequenza in soluzioni di xilene per 2 x 15 minuti, soluzioni di etanolo anidro per 2 x 15 minuti, soluzione di etanolo al 90% per 10 minuti, soluzione di etanolo all'85% per 10 minuti, soluzione di etanolo all'80% per 10 minuti e soluzione di etanolo al 75% per 10 minuti, Segue il lavaggio dei vetrini con acqua sterilizzata per 3 x 1 min. NOTA: Questa tecnica sperimentale può essere utilizzata solo per il tessuto FFPE, non per il tessuto congelato o fresco, poiché il processo di riparazione multipla dell'antigene ad alta temperatura provoca la caduta del tessuto dal vetrino.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ottimizzazione dell'anticorpo primario
NOTA: Gli esperimenti IHC convenzionali sono stati utilizzati per determinare le condizioni di incubazione per i singoli anticorpi, includendo principalmente la concentrazione di anticorpi e le condizioni di riparazione dell'antigene. Fare riferimento alle condizioni nel manuale di istruzioni dell'anticorpo.
<ol><li>Utilizzare una concentrazione di anticorpi leggermente superiore all'intervallo di concentrazione raccomandato e ai valori intermedi.</li>
	<li>Ottimizza le routine del tampone di recupero dell'antigene PH6 e PH9 in base alla posizione di espressione della proteina. Utilizzare PH9 per le proteine espresse nel nucleo e utilizzare una delle due proteine di routine (PH6 o PH9) per le altre proteine.</li>
</ol>3. Metodo di colorazione mIHC
NOTA: La colorazione mIHC opale è uno dei metodi mIHC disponibili. In questo protocollo sperimentale a 5 colori, poiché ogni campione di tessuto deve essere colorato con quattro anticorpi, sono necessarie quattro incubazioni di anticorpi primari, incubazioni di anticorpi secondari e incubazioni cromogeniche di amplificazione del segnale TSA, nonché cinque ripristini di antigeni. Infine, vengono eseguite la colorazione con 4'6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e la sigillatura dell'agente di scoppio antifluorescente.
<ol><li>Preparazione del reagente principale NOTA: Determinare la quantità di reagente da aggiungere in base alle dimensioni dei vetrini di tessuto. Utilizzare un volume sufficiente a coprire completamente la sezione del tessuto (generalmente, 50-150 μL per vetrino). Le soluzioni di lavoro necessarie per l'esperimento sono preparate come segue:<ol><li>Soluzione di lavoro tampone di lavaggio: diluire 20 volte tampone di lavaggio a 1:20 con acqua bidistillata e conservare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Soluzione tampone PH6: Diluire 100x tampone PH6 a 1:100 con acqua bidistillata. Preparare prima dell'uso e conservare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Soluzione tampone PH9: Diluire 50x tampone PH9 a 1:50 con acqua bidistillata. Preparare prima dell'uso e conservare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Polimero HRP: Preparare questa soluzione pronta all'uso solo per gli anticorpi primari di origine di coniglio e topo.</li>
		<li>Soluzione di lavoro al fluoroforo: ricostituire ogni polvere di fluoroforo (tranne il fluoroforo 780) in 75 μL di DMSO. Prima di ogni procedura, diluire il fluoroforo in 1x diluente di amplificazione a 1:100. Scartare la parte non utilizzata della soluzione di lavoro al fluoroforo.</li>
		<li>Soluzione di lavoro Fluorophore 780: Ricostituire TSA-DIG in 75 μL di DMSO e la polvere di fluoroforo 780 in 300 μL di acqua bidistillata. Prima della procedura, diluire TSA-DIG in 1x diluente di amplificazione a 1:100 e diluire il fluoroforo 780 con il diluente Ab a 1:25.</li>
		<li>Soluzione di lavoro DAPI: Diluire la soluzione DAPI a 1:50 con acqua bidistillata o PBS. Preparare prima dell'uso e conservare a 4 °C per non più di 48 ore. NOTA. Lavare i vetrini solo con acqua bidistillata e soluzione di lavoro tampone di lavaggio appena preparata durante questo esperimento di colorazione a fluorescenza multietichetta. Le sezioni di tessuto non devono entrare in contatto con l'acqua del rubinetto; I contaminanti nell'acqua del rubinetto possono aderire alle sezioni di tessuto e causare l'autofluorescenza. Tenere i campioni lontani dalla luce per tutta la durata dell'esperimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Recupero dell'antigene<ol><li>Mettere i vetrini in una scatola per colorare e riparare e riempirla con soluzione tampone PH6 o PH9, coprire con il coperchio e riscaldare in forno a microonde per 2 x 8 minuti al 100% della potenza. NOTA: Aggiungere acqua bidistillata alla scatola di riparazione durante il processo di riscaldamento per evitare un'eccessiva evaporazione che può causare l'essiccazione delle fette.</li>
		<li>Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente prima di procedere (30-60 min).</li>
		<li>Lavare i vetrini 3 x 2 minuti con acqua bidistillata. Utilizzare una penna barriera idrofobica per circondare la sezione di tessuto sul vetrino.</li>
	</ol></li>
	<li>Inceppamento<ol><li>Immergere le sezioni di tessuto nel tampone di lavaggio, coprire con una soluzione bloccante e incubare i vetrini in una camera umidificata a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubazione di anticorpi primari<ol><li>Rimuovere la soluzione bloccante dai vetrini e coprire le sezioni di tessuto con la soluzione di lavoro dell'anticorpo primario. Incubare i vetrini in camera umidificata per 1 ora a 37 °C nell'incubatrice o per una notte a 4 °C in frigorifero. NOTA: Non lasciare che i vetrini si asciughino.</li>
	</ol></li>
	<li>Introduzione del polimero HRP<ol><li>Lavare i vetrini in una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 minuti. Aggiungere Polymer HRP direttamente goccia a goccia sulle sezioni di tessuto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Per i vetrini conservati in frigorifero, tenerli a temperatura ambiente per circa 30 minuti prima del lavaggio per rimuovere l'anticorpo primario.</li>
	</ol></li>
	<li>Generazione di amplificazione del segnale della tiramina (TSA)<ol><li>Lavare il vetrino con una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 minuti, aggiungere la soluzione di lavoro al fluoroforo direttamente goccia a goccia sulle sezioni di tessuto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare il vetrino con una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedura speciale per fluoroforo 780 NOTA: Il fluoroforo 780 è debole ed è regolarmente posizionato all'ultimo posto nello schema di corrispondenza dei colori dell'intero esperimento. Il fluoroforo 780 non è normalmente utilizzato in questo protocollo sperimentale, ma a causa della sua specificità, sono elencate le sue fasi sperimentali.<ol><li>Introduzione di TSA-DIG<ol><li>Lavare il vetrino con una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 minuti, aggiungere la soluzione di lavoro TSA-Drg goccia a goccia sulle sezioni di tessuto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		</ol></li>
		<li>Trattamento a microonde<ol><li>Lavare i vetrini con una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 min.</li>
			<li>Metti i vetrini in una scatola per colorare e riparare, riempila con la soluzione di riparazione, copri con il coperchio e riscalda in un forno a microonde per 2 x 8 minuti al 100% della potenza. Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente prima di procedere (30-60 min).</li>
			<li>Lavare i vetrini per 3 x 2 minuti con acqua bidistillata.</li>
		</ol></li>
		<li>Generazione del segnale Fluorophore 780<ol><li>Immergere le sezioni in tampone di lavaggio, coprire con soluzione di lavoro fluorophore 780 e incubare i vetrini in una camera umidificata per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
			<li>Lavare i vetrini con una soluzione tampone di lavaggio per 3 x 2 min. NOTA: NON eseguire il trattamento a microonde dopo questo passaggio.</li>
		</ol></li>
		<li>Utilizzare il fluoroforo 780 come ultima fase dell'intero flusso di lavoro e quindi colorare i nuclei direttamente con la soluzione di lavoro DAPI. NOTA: Saltare il passaggio 3.7 se non si utilizza fluorophore 780.</li>
	</ol></li>
	<li>Trattamento a microonde NOTA: Questo passaggio a microonde rimuove il complesso HRP primario-secondario e riespone gli antigeni, consentendo l'introduzione dell'anticorpo primario successivo.<ol><li>Mettere i vetrini in una scatola per colorare e riparare, riempirla con la soluzione tampone PH6 o PH9, coprire con il coperchio e riscaldare in un forno a microonde per 2 x 8 minuti al 100% della potenza.</li>
		<li>Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente prima di procedere (30-60 min). Lavare i vetrini 3 x 1 min con acqua bidistillata.</li>
		<li>Immergere i vetrini nella soluzione di lavoro tampone di lavaggio per 2 min. Eseguire la successiva incubazione degli anticorpi.</li>
	</ol></li>
	<li>Successiva incubazione degli anticorpi<ol><li>Ripetere i passaggi 3.2-3.8 (tranne il passaggio 3.7).</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione nucleare cellulare e sigillatura tissutale<ol><li>Coprire le sezioni di tessuto con la soluzione di lavoro DAPI e incubare i vetrini in una camera umidificata per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini per 3 x 2 minuti con acqua bidistillata.</li>
		<li>Rimuovere le gocce d'acqua dai vetrini, aggiungere 10-20 μL di quencher antifluorescenza a ciascun vetrino e sigillare i vetrini con un vetro di copertura per microscopio.</li>
		<li>Conservare i vetrini finiti a 4 °C, al riparo dalla luce, per più di 1 mese. NOTA: Fare attenzione ad evitare bolle d'aria.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Impostare il controllo negativo
<ol><li>Elaborare i vetrini di controllo negativo come i vetrini contenenti tessuto, ma senza l'aggiunta di reagenti come anticorpi primari, anticorpi secondari, reagenti TSA e DAPI, che vengono utilizzati per rimuovere l'autofluorescenza tissutale durante la scansione della pellicola.</li>
</ol>5. Scansione completamente automatica di vetrini di tessuto
NOTA: L'apparecchiatura utilizzata per l'imaging spettrale è un analizzatore di quantificazione tissutale multispettrale completamente automatizzato e la visualizzazione dell'imaging e dell'analisi di vetrini a 5 colori può essere eseguita utilizzando il sistema di riferimento (vedere la tabella dei materiali). Il sistema utilizza l'imaging multispettrale per la miscelazione quantitativa di più fluorofori e l'autofluorescenza tissutale.
<ol><li>Impostare manualmente il tempo di esposizione e il programma di scansione per ciascun canale di fluorescenza e verificare che lo strumento abbia completato l'esposizione e la scansione completamente automatiche dei vetrini di tessuto. NOTA: La superficie del vetrino deve essere pulita e priva di pellicole d'acqua. Attenzione alla quantità di sigillante: una quantità eccessiva farà scivolare il vetrino coprioggetto e lo strumento riporterà un errore.</li>
</ol>6. Analisi della fluorescenza
<ol><li>Fare doppio clic sul software (vedere la Tabella dei materiali), trascinare il file di immagine a fluorescenza multicolore ottenuto dalla scansione originale nel software e impostare il tipo di immagine su fluorescenza.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Luminosità e contrasto e controllare i canali sul pannello. Fare clic all'esterno e quindi sul canale per selezionare il canale di fluorescenza di interesse. Trascinare il display Min e il display Max per regolare la luminosità e il contrasto di ciascun canale.</li>
	<li>Dopo l'analisi, determinare la vista da salvare, fare clic su Mostra panoramica diapositiva e Mostra posizione cursore per rimuovere questi due contenuti, mantenere la barra della scala e fare clic su File | Esporta snapshot | Contenuto del visualizzatore corrente per esportare un file png. NOTA: Ogni canale di fluorescenza e una figura unita devono essere esportati per analisi future.</li>
	<li>Per un'ulteriore analisi della positività delle cellule bersaglio, utilizzare il software di identificazione e segmentazione delle cellule21 (vedere la tabella dei materiali).</li>
</ol>

Decifrazione del microambiente tumorale utilizzando mIHC nel carcinoma squamoso polmonare

<ol>
	<li>Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescent+in+situ+hybridization+and+immunohistochemical+detection+with+tyramide+signal+amplification.">Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).</li><li>Lovisa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+induces+cell+cycle+arrest+and+parenchymal+damage+in+renal+fibrosis.">Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis.</a> Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).</li><li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+with+pembrolizumab+in+advanced+Merkel-cell+carcinoma.">PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li><li>Zaretsky, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+associated+with+acquired+resistance+to+PD-1+blockade+in+melanoma.">Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogeneous+immune+landscape+between+lung+adenocarcinoma+and+squamous+carcinoma+revealed+by+single-cell+RNA+sequencing.">The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).</li><li>Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. 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(143), 58390 (2019).</li><li>Lazarus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization,+design+and+avoiding+pitfalls+in+manual+multiplex+fluorescent+immunohistochemistry.">Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging:+a+review+of+its+technical+aspects+and+applications+in+anatomic+pathology.">Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).</li><li>Gustavson, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+the+statistical+analysis+of+multiplex+immunofluorescence+data.">Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data.</a> Cancers. 13 (12), 3031 (2021).</li><li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+tumor+immune+microenvironment+with+Tyramide-based+multiplex+immunofluorescence.">Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+context+in+epigenetics:+quantitative+multicolor+imaging+and+automated+per-cell+analysis+of+miRNAs+and+their+putative+targets.">Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets.</a> Methods. 52 (4), 271-280 (2010).</li></ol>

Tutti gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.

La mIHC è una tecnica sperimentale indispensabile nel campo della ricerca scientifica per l'analisi quantitativa e spaziale di più marcatori proteici a livello di singola cellula in una singola sezione tissutale, fornendo dati intuitivi e accurati per lo studio della patologia patologica concentrandosi sulla struttura tissutale dettagliata e sulle interazioni cellulari nel contesto del tessuto originale. L'adozione diffusa della tecnologia mIHC richiederà protocolli sperimentali ottimizzati ed efficaci. Per affrontare...

L'amplificazione del segnale della tiramina (TSA), che ha una storia di oltre 20 anni, è una classe di tecniche di analisi che utilizzano la perossidasi di rafano (HRP) per la marcatura in situ ad alta densità di antigeni bersaglio ed è ampiamente applicata nei saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), nell'ibridazione in situ (ISH), nell'immunoistochimica (IHC) e in altre tecniche per la rilevazione di antigeni biologici. migliorare in modo sostanziale la sensibilità del segnale rilevato1. La colorazione policromatica opalina basata sulla tecnologia TSA è stata recentemente sviluppata e ampiamente utilizzata in diversi studi 2,3,4,5. La colorazione tradizionale a immunofluorescenza (IF) fornisce ai ricercatori uno strumento semplice per il rilevamento e il confronto della distribuzione delle proteine nelle cellule e nei tessuti di vari organismi modello. Si basa sul legame anticorpo-antigene-specifico e comprende approcci diretti e indiretti6. L'immunocolorazione diretta prevede l'uso di un anticorpo primario coniugato con fluorofori contro l'antigene di interesse, che consente la rilevazione diretta della fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza. L'approccio di immunocolorazione indiretta prevede l'applicazione di un anticorpo secondario coniugato con fluorofori contro l'anticorpo primario non coniugato 6,7.
I metodi tradizionali di colorazione a immunofluorescenza a etichetta singola possono colorare solo uno, due o, in alcuni casi, tre antigeni nei tessuti, il che rappresenta una delle principali limitazioni nell'estrazione delle ricche informazioni contenute nelle sezioni di tessuto. L'interpretazione dei risultati quantitativi dipende spesso dall'osservazione visiva e dalla quantificazione accurata da parte di software di imaging, come ImageJ. Esistono limitazioni tecniche, come la restrizione delle specie di anticorpi, i segnali deboli dell'etichetta fluorescente e la sovrapposizione dei colori dei coloranti fluorescenti (Tabella 1). La tecnica Opal multiplex IHC (mIHC) si basa sulla derivazione TSA, che consente la colorazione multiplex e la marcatura differenziale di più di 7-9 antigeni sulla stessa sezione di tessuto, senza restrizioni sull'origine dell'anticorpo primario, ma richiede un'elevata specificità dell'anticorpo corrispondente contro l'antigene. La procedura di colorazione è simile a quella della normale colorazione a immunofluorescenza, ad eccezione di due differenze: ogni ciclo di colorazione prevede l'uso di un solo anticorpo e viene aggiunta una fase di eluizione dell'anticorpo. Gli anticorpi legati all'antigene da legami non covalenti possono essere rimossi mediante eluizione a microonde, ma il segnale fluorescente TSA legato alla superficie dell'antigene da legami covalenti viene mantenuto.
Le molecole di tiramina (T) attivate marcate con il colorante sono altamente arricchite a livello dell'antigene bersaglio, consentendo un'efficiente amplificazione del segnale fluorescente. Ciò consente la marcatura diretta dell'antigene senza interferenze anticorpali e quindi la marcatura multicolore può essere ottenuta dopo più cicli di colorazione 8,9,10 (Figura 1). Sebbene questa tecnologia produca immagini affidabili e accurate per lo studio della malattia, la creazione di un'utile strategia di colorazione con immunoistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) può richiedere molto tempo e impegnatività a causa della necessità di un'ampia ottimizzazione e progettazione. Pertanto, questo protocollo del pannello multiplex è stato ottimizzato in un coloratore IHC automatizzato con un tempo di colorazione più breve rispetto a quello del protocollo manuale. Questo approccio può essere applicato e adattato direttamente da qualsiasi ricercatore per studi di immuno-oncologia su campioni di tessuto umano fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE)11. Inoltre, i metodi per la preparazione dei vetrini, l'ottimizzazione degli anticorpi e la progettazione multiplex saranno utili per ottenere immagini robuste che rappresentino accurate interazioni cellulari in situ e per abbreviare il periodo di ottimizzazione per l'analisi manuale12.
L'mfIHC comprende principalmente l'acquisizione di immagini e l'analisi dei dati. In termini di acquisizione di immagini, i campioni colorati con complessi marcati multicolore devono essere rilevati con apparecchiature di imaging spettrale professionali per identificare i vari segnali di colore misti e ottenere immagini ad alto rapporto segnale-rumore senza interferenze dovute all'autofluorescenza dei tessuti. Le attuali apparecchiature per l'imaging spettrale comprendono principalmente microscopi confocali spettrali e sistemi di imaging tissutale multispettrale. Il sistema di imaging tissutale multispettrale è un sistema di imaging professionale progettato per l'analisi quantitativa di sezioni di tessuto e la sua caratteristica più importante è l'acquisizione di informazioni spettrali di immagine, che forniscono sia informazioni sulla struttura morfologica che sulla mappatura ottica di campioni di tessuto biologico13,14. Ogni pixel nell'immagine spettrale contiene una curva spettrale completa e ogni colorante (compresa l'autofluorescenza) ha il suo spettro caratteristico corrispondente, che consente la registrazione completa e l'identificazione accurata di segnali multietichetta misti e sovrapposti.
In termini di analisi dei dati, i campioni marcati multicolore sono estremamente complessi a causa della struttura morfologica e delle cellule costituenti i campioni di tessuto. Il software ordinario non è in grado di identificare automaticamente i diversi tipi di tessuto. Pertanto, il software intelligente di analisi quantitativa dei tessuti viene utilizzato per l'analisi quantitativa dell'espressione dell'antigene in regioni specifiche 15,16,17,18.
Soprattutto, la colorazione a immunofluorescenza multimarca fusa con l'imaging multispettrale e la tecnologia di analisi patologica quantitativa presenta i vantaggi di un gran numero di bersagli di rilevamento, di una colorazione efficace e di un'analisi accurata, e può quindi migliorare significativamente l'accuratezza dell'analisi istomorfologica, rivelare la relazione spaziale tra le proteine con risoluzione a livello cellulare e aiutare a estrarre informazioni più ricche e affidabili da campioni di sezioni di tessuto19 (Tabella 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab237709</td>
			<td>Primary antibody, 1/100, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab955</td>
			<td>Primary antibody, 1/300, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CK5/6</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1620</td>
			<td>Primary antibody, 1/150, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HMGCS1</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX112346</td>
			<td>Primary antibody, 1/300, PH6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal nonimmune serum</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>SP KIT-B3</td>
			<td>Antigen blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Anti-fluorescent burst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit</td>
			<td>Akoya</td>
			<td>NEL861001KT</td>
			<td>Opal mIHC Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K8000/K8002/K8007/K8023</td>
			<td>Washing the tissues slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, paid software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, paid software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Vectra</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath 0.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue

Il cancro del polmone è la principale causa di morbilità e mortalità correlata al tumore maligno in tutto il mondo e il complesso microambiente tumorale è stato considerato la principale causa di morte nei pazienti affetti da cancro al polmone. La complessità del microambiente tumorale richiede metodi efficaci per comprendere le relazioni cellula-cellula nei tessuti tumorali. La tecnica dell'immunoistochimica multipla (mIHC) è diventata uno strumento chiave per dedurre la relazione tra l'espressione delle proteine a monte e a valle delle vie di segnalazione nei tessuti tumorali e per sviluppare diagnosi cliniche e piani di trattamento. mIHC è un metodo di colorazione a immunofluorescenza multi-etichetta basato sulla tecnologia Tyramine Signal Amplification (TSA), in grado di rilevare simultaneamente più molecole bersaglio sullo stesso campione di sezione di tessuto per ottenere diverse analisi di co-espressione e co-localizzazione delle proteine. In questo protocollo sperimentale, sezioni di tessuto di carcinoma squamoso polmonare di origine clinica incluse in paraffina sono state sottoposte a colorazione immunoistochimica multiplex. Ottimizzando il protocollo sperimentale, è stata ottenuta la colorazione immunoistochimica multiplex di cellule e proteine bersaglio marcate, risolvendo il problema dell'autofluorescenza e della diafonia dei canali nei tessuti polmonari. Inoltre, la colorazione immunoistochimica multiplex è ampiamente utilizzata nella convalida sperimentale del sequenziamento ad alto rendimento correlato al tumore, tra cui il sequenziamento di singole cellule, la proteomica e il sequenziamento dello spazio tissutale, fornendo risultati intuitivi e visivi di convalida della patologia.

Tyramine signal amplification (TSA), which has a history of more than 20 years, is a class of assay techniques that use horseradish peroxidase (HRP) for high-density in situ labeling of target antigens and is widely applied in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), in situ hybridization (ISH), immunohistochemistry (IHC), and other techniques for the detection of biological antigens, substantially improving the sensitivity of the detected signal1. Opal polychromatic staining based on TSA technology has been recently developed and widely used in several studies2,3,4,5. Traditional immunofluorescence (IF) staining provides researchers with an easy tool for the detection and comparison of the distribution of proteins in the cells and tissues of various model organisms. It is based on antibody-/antigen-specific binding and includes direct and indirect approaches6. Direct immunostaining involves the use of a fluorophore-conjugated primary antibody against the antigen of interest, which enables direct fluorescent detection using a fluorescence microscope. The indirect immunostaining approach involves the application of a fluorophore-conjugated secondary antibody against the unconjugated primary antibody6,7.
Traditional, single-label, immunofluorescence staining methods can stain only one, two, or in some cases, three antigens in tissues, which is a major limitation in mining the rich information contained in tissue sections. The interpretation of quantitative results often depends on visual observation and accurate quantification by imaging software, such as ImageJ. There are technical limitations, such as antibody species restriction, weak fluorescent label signals, and fluorescent dye color overlap (Table 1). The Opal multiplex IHC (mIHC) technique is based on TSA derivation, which allows multiplex staining and differential labeling of more than 7-9 antigens on the same tissue section, with no restriction on the origin of the primary antibody, but requires high specificity of the corresponding antibody against the antigen. The staining procedure is similar to that of normal immunofluorescence staining, except for two differences: each round of staining involves the use of only one antibody and an antibody elution step is added. Antibodies bound to the antigen by noncovalent bonds can be removed by microwave elution, but the TSA fluorescent signal bound to the surface of the antigen by covalent bonds is retained.
Activated tyramine (T) molecules labeled with the dye are highly enriched at the target antigen, allowing efficient amplification of the fluorescent signal. This allows direct labeling of the antigen without antibody interference, and then multicolor labeling can be achieved after multiple staining cycles8,9,10 (Figure 1). Although this technology produces reliable and accurate images for the study of disease, the creation of a useful multiplex fluorescent immunohistochemistry (mfIHC) staining strategy can be time-consuming and exacting due to the need for extensive optimization and design. Therefore, this multiplex panel protocol has been optimized in an automated IHC stainer with a shorter staining time than that of the manual protocol. This approach can be directly applied and adapted by any researcher for immuno-oncology studies on human formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue samples11. Moreover, the methods for slide preparation, antibody optimization, and multiplex design will be helpful in obtaining robust images that represent accurate cellular interactions in situ and to shorten the optimization period for manual analysis12.
The mfIHC mainly includes image acquisition and data analysis. In terms of image acquisition, multicolor-labeled complex-stained samples need to be detected with professional spectral imaging equipment to identify the various mixed color signals and obtain high signal-to-noise images without interference from tissue autofluorescence. Current equipment for spectral imaging mainly includes spectral confocal microscopes and multispectral tissue imaging systems. The multispectral tissue imaging system is a professional imaging system designed for the quantitative analysis of tissue sections, and its most important feature is the acquisition of image spectral information, which provides both morphological structure and optical mapping information of biological tissue samples13,14. Any pixel in the spectral image contains a complete spectral curve, and each dye (including autofluorescence) has its corresponding characteristic spectrum, which enables the complete recording and accurate identification of mixed and overlapping multilabel signals.
In terms of data analysis, multicolor-labeled samples are extremely complex due to the morphological structure and constituent cells of the tissue samples. Ordinary software cannot automatically identify different tissue types. Hence, intelligent quantitative tissue analysis software is used for quantitative analysis of antigen expression in specific regions15,16,17,18.
Above all, multilabel immunofluorescence staining fused with multispectral imaging and quantitative pathology analysis technology has the advantages of a large number of detection targets, effective staining, and accurate analysis, and it can therefore significantly improve the accuracy of histomorphological analysis, reveal the spatial relationship between proteins with cellular-level resolution, and help to mine richer and more reliable information from tissue section samples19 (Table 1).

Autore in primo piano: Miglioramento della localizzazione della fluorescenza multicolore in un campione di carcinoma polmonare

Colorazione immunoistochimica multiplex per tessuto di carcinoma polmonare incluso in paraffina

Our research focused on optimizing the mIHC protocol on paraffin section obtained from clinic sources. We aimed to effectively address autofluorescence and autofluorescence channel crosstalk issues in lung tissue. The current experimental challenges we are facing involve addressing the issues of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissue, whereby achieving successful multicolor fluorescence localization they need for labeled target cells and proteins.Our highly efficient multiple antigen in situ labeling method, which requires less than three hours per antibody, seamlessly integrates a multispectral imaging system and a specialized pathology software. This optimized mIHC protocol is easily adaptable for use in other research laboratories.

Abbiamo ottimizzato lo schema di corrispondenza dell'anticorpo primario CD8 e dei fluorofori. Entrambi i set di risultati di fluorescenza corrispondevano esattamente alle stesse condizioni di incubazione dell'anticorpo nel gruppo sperimentale, ad eccezione del cambiamento nel fluoroforo abbinato all'anticorpo. Come mostrato nella Figura 2, c'era una differenza significativa nella corrispondenza dei canali delle cellule T CD8+ con il fluoroforo 480 e il fluoroforo 690. Il canale con il fluoro...

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Questo protocollo sperimentale descrive e ottimizza un metodo di colorazione immunoistochimica multiplex (IHC), principalmente ottimizzando le condizioni di incubazione degli anticorpi a canale singolo e regolando le impostazioni degli anticorpi e dei canali per risolvere i problemi di autofluorescenza e diafonia dei canali nei tessuti di cancro del polmone di origine clinica.

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

La nostra ricerca si è concentrata sull'ottimizzazione del protocollo mIHC sulla sezione di paraffina ottenuta da fonti cliniche. Il nostro obiettivo era quello di affrontare efficacemente i problemi di diafonia dell'autofluorescenza e dei canali di autofluorescenza nel tessuto polmonare. Le attuali sfide sperimentali che stiamo affrontando riguardano l'affrontare i problemi dell'autofluorescenza e della diafonia dei canali nel tessuto polmonare, ottenendo con successo la localizzazione della fluorescenza multicolore di cui hanno bisogno per le cellule e le proteine bersaglio marcate.Il nostro metodo di marcatura in situ di antigeni multipli altamente efficiente, che richiede meno di tre ore per anticorpo, integra perfettamente un sistema di imaging multispettrale e un software di patologia specializzato. Questo protocollo mIHC ottimizzato è facilmente adattabile per l'uso in altri laboratori di ricerca.

multiplex-immunohistochemistry-staining-for-paraffin-embedded-lung

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

1.2K Views.  Sichuan University. La nostra ricerca si è concentrata sull'ottimizzazione del protocollo mIHC sulla sezione di paraffina ottenuta da fonti cliniche. Il nostro obiettivo era quello di affrontare efficacemente i problemi di diafonia dell'autofluorescenza e dei canali di autofluorescenza nel tessuto polmonare. Le attuali sfide sperimentali che stiamo affrontando riguardano l'affrontare i problemi dell'autofluorescenza e della diafonia dei canali nel tessuto polmonare, ottenendo con successo la localizzazione dell...

Video: Autore in primo piano: Miglioramento della localizzazione della fluorescenza multicolore in un campione di carcinoma polmonare

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been considered the leading cause of death in lung cancer patients. The complexity of the tumor microenvironment requires effective methods to understand cell-to-cell relationships in tumor tissues. The multiplex immunohistochemistry (mIHC) technique has become a key tool for inferring the relationship between the expression of proteins upstream and downstream of signaling pathways in tumor tissues and developing clinical diagnoses and treatment plans. mIHC is a multi-label immunofluorescence staining method based on Tyramine Signal Amplification (TSA) technology, which can simultaneously detect multiple target molecules on the same tissue section sample to achieve different protein co-expression and co-localization analysis. In this experimental protocol, paraffin-embedded tissue sections of lung squamous carcinoma of clinical origin were subjected to multiplex immunohistochemical staining. By optimizing the experimental protocol, multiplex immunohistochemical staining of labeled target cells and proteins was achieved, solving the problem of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissues. In addition, multiplex immunohistochemical staining is widely used in the experimental validation of tumor-related, high-throughput sequencing, including single-cell sequencing, proteomics, and tissue space sequencing, providing intuitive and visual pathology validation results.

This experimental protocol describes and optimizes a multiplex immunohistochemistry (IHC) staining method, mainly by optimizing single-channel antibody incubation conditions and adjusting the settings of antibodies and channels to solve the problems of autofluorescence and channel crosstalk in lung cancer tissues of clinical origin.

Ricerca

Ricerca sul cancro

Optimizing Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Staining for Lung Cancer Tissue Samples to Address Autofluorescence Issues

To begin, obtain previously prepared formula and fixed and paraffin embedded lung cancer tissue sample slide. Incubate it at 65 degrees Celsius for five minutes. Perform dehydration by immersing the slide in xylene, followed by ethanol solutions of decreasing concentrations.Then immerse the slides in sterilized water three times for one minute each. For antigen retrieval, place the slide in a staining and repair box. Fill it with immunohistochemical antigen repair buffer working solution of pH six or nine.Cover the box with a lid, and heat it in a microwave oven for eight minutes at 100%power. Then cool the slide to room temperature. Cover the tissue with a blocking solution, and then incubate in a humidified chamber at room temperature for 10 minutes.After removing the blocking solution, cover the slide with the primary antibody working solution, and place it in a humidified chamber. Then incubate this chamber for one hour at 37 degrees Celsius. Next, wash the slide with wash buffer working solution for two minutes.Add polymer horseradish peroxidase directly dropwise onto the slide, and incubate it for 15 minutes at room temperature. After washing the slide, add fluorophore working solution directly dropwise onto the slide, and incubate it for 10 minutes at room temperature. Once the slide is washed, give microwave treatment as demonstrated previously.When the slide is cooled to room temperature, wash it three times with double distilled water for one minute each. Next, dip the slide in the wash buffer working solution for two minutes, and perform antibody incubation, horseradish peroxidase, and fluorophore addition as demonstrated. For cell nuclear staining, cover the slide with DAPI working solution and incubate it in a humidified chamber for five minutes at room temperature.Then wash the slides with double distilled water three times, one minute each. Remove water droplets from the slide. Add 10 to 20 microliters of anti-fluorescence quencher to the slide, and seal it with a microscope cover glass.

Ottimizzazione della colorazione con immunoistochimica multiplex (mIHC) per campioni di tessuto di cancro del polmone per risolvere i problemi di autofluorescenza

Analyzing Fluorescence in Lung Cancer Tissue Samples Stained with Optimized Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Technique

To begin, obtain previously prepared stained lung cancer tissue sample slides. For automatic scanning of the stained slides, manually set the exposure time and scanning program for each fluorescence channel. Drag the multicolor fluorescence image file obtained from the original scan into the software and set the image type to fluorescence.Click the brightness and contrast button and check the channels on the panel. Click outside and then on the channel to select the fluorescence channel of interest. Drag the minimum display and maximum display to adjust the brightness and contrast of each channel.Once the view to be saved is determined, click on show slide overview and show cursor location to remove these two contents and keep the scale bar. Click file followed by export snapshot and current viewer content To export a PNG file. The non-small cell lung squamous carcinoma tissues showed that macrophages and CD eight positive T-cells significantly infiltrated around and within carcinoma foci.HMGCS1 protein exhibited widespread expression in squamous carcinoma cell plasma.