Per iniziare, utilizzare i primer specifici 515f e 806r per amplificare la regione ipervariabile V4 del gene rNA 16S. Eseguire la PCR utilizzando le condizioni indicate. Successivamente, aggiungere 3,5 microlitri di tampone di sequenziamento e 1,5 microlitri di miscela enzimatica nella provetta.
Dopo aver miscelato e centrifugato il campione, impostare una reazione del termociclatore. Ora, aggiungi la miscela di legatura dell'adattatore nella provetta e incuba a 20 gradi Celsius per 15 minuti in un termociclatore. Aggiungere 1,5 microlitri di enzima reagente di estensione specifico dell'uracile alla miscela di legatura e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Ora, aggiungi 43,5 microlitri di perline magnetiche al DNA di legatura dell'adattatore e mescola 20 volte. Dopo cinque minuti, posizionare la provetta in un rack magnetico per 5-10 minuti per la separazione delle microsfere e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 100 microlitri di etanolo all'80% e asciugare le perle per 30 secondi.
Per eluire le perle in pellet, aggiungere 8,5 microlitri di Tris HCl da 10 millimolari nella provetta e incubare per due minuti. Posizionare la provetta in un rack magnetico e rimuovere 7,5 microlitri di DNA eluso come surnatante in una nuova provetta. Aggiungere i reagenti PCR alla provetta contenente DNA legata adattatore per impostare una reazione da 25 microlitri.
Per pulire il DNA amplificato, aggiungere 22,5 microlitri di microsfere magnetiche nella provetta e mescolare 20 volte. Dopo cinque minuti, rimuovere 50 microlitri di surnatante e lavare le perle con 100 microlitri di etanolo all'80%. Risospendere le perle marrone scuro in 16 microlitri d'acqua e mescolare 20 volte.
Posizionare la provetta nella griglia magnetica per 30-60 secondi e trasferire 15 microlitri in una nuova provetta. Mescola 90 microlitri di tampone, un microlitro di colorante e due microlitri di campione di libreria di DNA e leggi la concentrazione di DNA su un fluorimetro. Dopo aver diluito il DNA a due nanomolari, caricare da 27 a 30 microlitri della cella di flusso e posizionarla nel sequenziatore.
Salvare i file FASTQ ottenuti dal sequencer. Fare clic per aprire un foglio di calcolo e creare un file di mappatura o di metadati. Apri il sito Web di Nephele, carica i file FASTQ e leggi QC End QIIME2, Eseguire il filtraggio e il taglio.
Successivamente, utilizzando DADA2, eseguire letture paired-end demultiplexate, sostituzione di filtri, errori di chimera e fusione. Utilizzare il classificatore Naive Bayes addestrato sull'unità tassonomica operativa del 99% versione 132 di Silva, o database OTU, per eseguire l'assegnazione tassonomica batterica al 97% di somiglianza. Apri il sito Web di MicrobiomeDB.
Fare clic per caricare i file e generare le curve di diversità alfa OTU, diversità beta, abbondanza relativa e rarefazione. Infine, apri un foglio di calcolo e trasferisci i dati per creare mappe termiche, diagrammi di Venn e analisi discriminante lineare che hanno effetto dimensione. Una mappa di calore basata sull'abbondanza relativa di batteri nelle diverse fasi della vinificazione ha mostrato la dominanza di phyla come Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota e Fusobacteriota.
A livello di genere, sono stati identificati generi importanti come Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae. Un'analisi del diagramma di Venn ha rivelato 15 OTU uniche condivise, dal mosto d'uva al vino finale. I risultati del sequenziamento degli ampliconi basati sulla regione variabile V4 hanno anche indicato la diversità alfa nelle due tramininette R e L.L'analisi della diversità ha mostrato uno spostamento dei batteri durante la fermentazione, ma la composizione batterica nel vino finale era simile a quella nelle fasi di aggiunta di mosto e lievito.
