Per iniziare, raccogli l'embrione di zebrafish e allevalo fino a 72 ore dopo la fecondazione in un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius. Preparare contemporaneamente le sostanze chimiche da testare alla concentrazione desiderata. Esaminare gli embrioni dopo la fecondazione a 72 ore.
Rimuovere gli embrioni morti o non ancora nati. Mettere 10 embrioni in ogni piastra di coltura tissutale di sei centimetri con nove millilitri di terreno E3. Queste sono chiamate piastre di esposizione.
Etichettare ogni piastra di esposizione con il nome del composto, la concentrazione di esposizione e il numero di replica. Aggiungere un millilitro di soluzione di esposizione a ciascuna piastra, iniziando dalla concentrazione più bassa e agitare delicatamente la piastra. Per i composti a bassa solubilità, sostituire tutti i 10 millilitri del mezzo con la soluzione di esposizione.
Registrare la sequenza in cui le soluzioni composte sono state aggiunte agli embrioni, quindi incubare le piastre nella camera umidificata all'interno di un'incubatrice a 28,5 gradi Celsius per 48 ore. Per iniziare il test di trasalizione da vibrazione, accendere il computer e il dispositivo di vibrazione. Creare un foglio di calcolo per il file di configurazione.
Includere le informazioni sull'esposizione per ciascuna delle cinque posizioni della piastra, specificando il composto, la concentrazione e la replica. Aprire l'interfaccia utente generale, o programma GUI, per il kit di analisi dello startle a vibrazione. Selezionare diverse posizioni nel programma GUI per controllare il movimento della telecamera e osservare la risposta della telecamera.
Rimuovere la piastra del campione dall'incubatrice. Posizionali nelle cinque posizioni designate e lascia riposare gli embrioni per alcuni minuti. Nel programma GUI, fare clic su registra e apparirà la nuova finestra.
In questa finestra, selezionare il file di configurazione preparato in precedenza. Verificare che la descrizione del campione corrisponda ai campioni in ogni posizione. Osservare il LED che si accende quando l'impulso sonoro viene attivato dal programma.
Dopo la registrazione, la fotocamera tornerà alla posizione uno e il software inizierà a comprimere i file. Sostituire i campioni misurati con il set successivo e procedere con l'esecuzione successiva come dimostrato. Quindi raccogliere le soluzioni di esposizione da tutte le piastre misurate, utilizzando un setaccio per trattenere contemporaneamente gli embrioni.
Per avviare l'analisi dei dati, aprire i dati video con il doppiaggio virtuale o un altro software di visualizzazione. Segna visivamente il numero di embrioni che rispondono all'impulso sonoro. Registra il nome del composto, la replica, la concentrazione del composto e la percentuale di embrioni mobili nel foglio di calcolo.
Conduci l'analisi della concentrazione di riferimento utilizzando un flusso di lavoro KNIME con script R incorporati. Una valutazione dell'immotilità in embrioni wild type non trattati ha mostrato un'immotilità media del 14,33% quando sottoposti a stimolo vibratorio, con variazioni tra le diverse frizioni. I calcoli di concentrazione di riferimento per gli effetti della tricaina sulla motilità hanno mostrato una riduzione della motilità all'1% di concentrazione, cessando l'attività al di sopra del 2,5% con una concentrazione di riferimento 50 di 164,9 micromolari.
Un esempio di test non ottimale ha mostrato incongruenze nelle risposte embrionali, il che implica problemi di sviluppo che influenzano la robustezza della risposta di trasalimento.
