Siamo grati per l'eccellente assistenza tecnica del personale di supporto presso la struttura ittica e il centro di screening IBCS-BIP. Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 965406 (PrecisionTox). Questo risultato riflette solo il punto di vista degli autori e l'Unione europea non può essere ritenuta responsabile per qualsiasi uso che possa essere fatto delle informazioni in esso contenute.

Tutti gli allevamenti e le manipolazioni del pesce zebra sono stati eseguiti in conformità con gli standard tedeschi di protezione degli animali e approvati dal governo del Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Germania (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT).
1. Preparazione delle soluzioni madre di sostanze chimiche da sottoporre a prova
<ol><li>Etichettare il flaconcino di vetro (o aliquota chimica) con il nome/abbreviazione del composto, la concentrazione della riserva e la data di preparazione. Ad esempio, CdCl2_2.5 g· L-1_210813.</li>
	<li>Centrifugare l'aliquota chimica a 2000 x g per 1 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Sotto una cappa aspirante, pesare il composto (se necessario) su una bilancia sensibile a 0,001 g e trasferirlo nel flaconcino etichettato. Se il composto è un liquido, aggiungerlo al flaconcino utilizzando una pipetta e un puntale di plastica. NOTA: Ad esempio, per lo stock di metansolfonato di tricaina utilizzato nell'esempio dei risultati mostrato nella Figura 2, sono stati pesati 400 mg nel flaconcino etichettato.</li>
	<li>Aggiungere il solvente (ad es. acqua pura sterile o dimetilsolfossido (DMSO), a seconda delle proprietà fisico-chimiche dei composti) utilizzando una pipetta e un puntale di plastica. Se possibile, l'acqua è il solvente preferito. NOTA: Ad esempio, per il brodo di tricaina, è stata preparata una soluzione di 15,3 mM in 100 mL di acqua.</li>
	<li>Sigillare il flaconcino, agitare delicatamente e verificare la presenza di precipitazioni.</li>
	<li>Preparare soluzioni madre diluite (se necessario) in flaconcini di vetro utilizzando pipette e puntali di plastica. NOTA: Ad esempio, non è stata necessaria un'ulteriore diluizione per il brodo di tricaina.</li>
	<li>Conservare la/e soluzione/i madre/e a -20 °C fino al momento dell'uso.</li>
	<li>Conservare l'aliquota chimica rimanente nelle stesse condizioni di prima.</li>
	<li>Registrare le informazioni sulle aliquote di magazzino nel quaderno di laboratorio.</li>
</ol>2. Raccolta e allevamento di embrioni di zebrafish
<ol><li>Raccogliere embrioni in fasi di scissione (stadio di 2-8 cellule) dalla deposizione naturale delle uova di accoppiamenti di gruppo in piastre di coltura tissutale da 10 cm.</li>
	<li>Selezionare un lotto di qualità adeguata: meno del 10% di ovuli non fecondati/morti.</li>
	<li>Pulire le stoviglie (rimuovere uova non fecondate, detriti, squame, ecc.).</li>
	<li>Posizionare 60 embrioni per piastra di coltura tissutale di 10 cm in 15 mL di terreno E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)25.</li>
	<li>Mettere i piatti in una camera umidificata preparata stendendo carta assorbente imbevuta d'acqua.</li>
	<li>Allevare gli embrioni fino a 72 hpf in un'incubatrice a 28,5 °C.</li>
</ol>3. Preparazione della diluizione di lavoro delle sostanze chimiche da sottoporre a prova
<ol><li>Rimuovere la soluzione madre dal congelatore a -20 °C e lasciarla scongelare.</li>
	<li>Se la solubilità del composto è sufficientemente elevata, preparare diluizioni seriali in terreno E3 in flaconi di vetro, 1 mL per replicato per concentrazione. Assicurarsi che la concentrazione sia 10 volte superiore alla concentrazione di esposizione desiderata. In questo modo si evita di dover cambiare l'intero mezzo degli embrioni all'inizio dell'esposizione. In caso di bassa solubilità, preparare le diluizioni seriali direttamente alle concentrazioni di esposizione desiderate, 10 mL per replicato per concentrazione.</li>
	<li>Verificare la presenza di precipitazioni (se necessario). Se la soluzione è precipitata, registrarla, quindi diluirla ulteriormente per ottenere la concentrazione successiva più alta. Controllare di nuovo la presenza di precipitazioni. Ripetere fino a quando non ci sono precipitazioni.</li>
	<li>Controllare il pH della soluzione di esposizione. Se al di fuori dell'intervallo di pH 7,0-8,5, registrarlo e preparare le soluzioni in E3 contenenti 5 mM di HEPES/pH 7,4, regolando il pH con HCl o NaOH.</li>
	<li>Smaltire i mezzi di esposizione non utilizzati secondo le normative locali.</li>
</ol>4. Esposizione degli embrioni alle sostanze chimiche da testare
<ol><li>Controllare le piastre con gli embrioni vecchi 72 hpf per gli embrioni morti/non schiusi e rimuoverli. Se un lotto di embrioni contiene più del 5% di ovuli non schiumati, rimuovere il lotto.</li>
	<li>Posizionare 10 embrioni per piastra di coltura tissutale da 6 cm in 9 mL di terreno E3 (piastra di esposizione).</li>
	<li>Etichettare le lastre di esposizione con il nome del composto, la concentrazione di esposizione e il numero di replica. Ad esempio, "CdCl2 1 mg· L-1 01". Includere un numero sufficiente di piastre solo E3 e una piastra di controllo del solvente, se necessario (vedere paragrafo 5).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di esposizione a ciascuna piastra, iniziando dalla concentrazione più bassa, e agitare la piastra. Per i composti a bassa solubilità, sostituire tutti i 10 mL della piastra con la soluzione di esposizione (vedere il passaggio 3.2).</li>
	<li>Registrare l'ordine temporale in cui le soluzioni composte sono state aggiunte agli embrioni.</li>
	<li>Incubare le piastre nella camera umidificata in un incubatore a 28,5 °C per 48 h fino a raggiungere i 120 hpf.</li>
</ol>5. Esecuzione del test di trasmittenza delle vibrazioni
NOTA: Analizzare le piastre nello stesso ordine in cui sono state registrate al punto 4.5. Ogni corsa dovrebbe includere una piastra di controllo E3.
<ol><li>Accendere il computer e il dispositivo di vibrazione (la luce LED blu dovrebbe essere accesa).</li>
	<li>Preparare il file di configurazione in un foglio di calcolo, come illustrato nella Figura 1D e allegato come file supplementare 1. Registrare le informazioni sull'esposizione per ciascuna delle 5 posizioni della piastra (composto, concentrazione, replica).</li>
	<li>Aprire il programma dell'interfaccia utente generale (GUI) (disponibile all'indirizzo https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit , ID progetto 43215).</li>
	<li>Controllare il movimento della telecamera selezionando le diverse posizioni nel programma GUI e osservando il movimento della telecamera.</li>
	<li>Estrarre le piastre dei campioni da misurare dall'incubatrice. Posizionare le piastre campione nelle 5 posizioni (vedere Figura 1A, "altoparlanti") e lasciare riposare gli embrioni per alcuni minuti.</li>
	<li>Fare clic su Registra; Si aprirà una finestra per selezionare il file di configurazione.</li>
	<li>Selezionare il file di configurazione appropriato preparato nel passaggio 5.2 per questa esecuzione.</li>
	<li>Verificare che la descrizione del campione corrisponda ai campioni in ciascuna posizione (1-5).</li>
	<li>La misurazione verrà eseguita automaticamente (10 s / posizione). Quando l'impulso sonoro viene applicato dal programma, si accende un LED. La registrazione per 10 s/posizione consente di acquisire dati sufficienti per stimare la velocità di nuoto e la distanza percorsa sia prima che dopo l'applicazione dello stimolo e previene l'assuefazione agli stimoli successivi.</li>
	<li>Al termine della registrazione, la fotocamera torna alla posizione 1 e il software inizia a comprimere i file. Durante questo periodo, sostituire i campioni con il set successivo che deve essere misurato.</li>
	<li>Andare al punto 5.2. per registrare l'esecuzione successiva.</li>
	<li>Quando tutte le lastre sono state misurate, raccogliere le soluzioni di esposizione. Utilizzare un setaccio per conservare gli embrioni.</li>
	<li>Sopprimere gli embrioni mediante raffreddamento rapido in un bagno di ghiaccio/isopropanolo (5%).</li>
	<li>Smaltire le soluzioni di esposizione e gli embrioni morti secondo le normative locali.</li>
</ol>6. Analisi dei dati
<ol><li>Apri i dati video con VirtualDub (1.10.4).</li>
	<li>Segna visivamente il numero di embrioni che rispondono all'impulso sonoro (quando il LED di controllo è acceso).</li>
	<li>Inserisci i dati in un foglio di calcolo. Registrare il nome del composto, la replica, la concentrazione del composto e la percentuale di embrioni immobili secondo il modello fornito nel file supplementare 2, che include il set di dati di esempio mostrato nella Figura 2C. NOTA: Il modello ha una struttura flessibile e consente principalmente l'applicazione di dati di altri organismi ed endpoint. Descrive le risposte per ciascuna concentrazione e fornisce anche descrizioni degli endpoint e definizioni dei parametri generati nella successiva modellazione concentrazione-risposta.</li>
	<li>Condurre l'analisi della concentrazione di riferimento (BMC) utilizzando un flusso di lavoro KNIME (KNIME analytics 4.626) con script R incorporati (R versione 3.6., pacchetti R plotrix, drc e bmd 27,28). NOTA: In linea di principio, la valutazione potrebbe anche essere condotta direttamente in R. Tuttavia, per comodità e per consentire la valutazione come servizio basato sul Web, l'analisi è stata organizzata in un flusso di lavoro conforme al server KNIME. L'output del flusso di lavoro KNIME è fornito nel file supplementare 3. Per informazioni dettagliate sui parametri statistici generati dal flusso di lavoro KNIME, fare riferimento a questo modello. I parametri statistici per stimare la bontà dell'adattamento e le soglie per accettare determinati valori di BMC sono riportati nella Tabella 1. Il flusso di lavoro KNIME stesso è disponibile tramite GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc). La concentrazione-risposta è modellata utilizzando un modello log-logistico a 4 parametri. È possibile fissare due dei parametri di adattamento della curva. In genere, si fissa il massimo a 100 nel caso di dati percentuali. Nel caso in cui non si osservino effetti di fondo, il minimo può essere fissato allo 0%.</li>
</ol>

Test di sorpresa per la valutazione della tossicità nell'embrione di zebrafish

Non abbiamo nulla da rivelare.

Presentiamo il flusso di lavoro e l'analisi dei dati per la valutazione dei composti chimici utilizzando una configurazione personalizzata del saggio di vibrazione dell'embrione di zebrafish. Il flusso di lavoro genera dati affidabili che consentono il calcolo di parametri tipici che specificano la tossicità del composto, come la concentrazione/dose di riferimento (BMC/BMD). La modularità della configurazione consente l'adattamento alle diverse esigenze di produttività e di spazio. Poiché il sistema è costituito da componenti basali a basso costo, seguendo una configurazione relativamente semplice, fornisce un'alternativa economica ai sistemi commerciali esistenti, che sono generalmente progettati per diversi tipi di test contemporaneamente, si basano su software proprietario e rimangono relativamente costosi.
Sia questi sistemi commerciali che altri sistemi personalizzati consentono la valutazione di singoli embrioni o larve in piastre multipozzetto (ad esempio, 12 pozzetti34, 16 pozzetti32,35, 24 pozzetti 20,33,36, 48 pozzetti37, 96 pozzetti 38,39,40,41,42 e persino 384 pozzetti [come pozzetto 4x96]43), ma la restrizione spaziale nei pozzi rende più impegnativa l'analisi di alcuni parametri di dati della risposta di fuga (ad esempio, la distanza percorsa). Inoltre, in alcune di queste configurazioni, l'imaging è limitato a un sottoinsieme dei pozzetti della piastra, riducendo la produttività36,39. L'imaging degli embrioni in piastre consente una migliore valutazione dei parametri di risposta alla fuga e consente di registrare il comportamento di più embrioni contemporaneamente (fino a 30 in una capsula di 6 cm, ad esempio). Di solito, l'imaging basato su piastre è limitato a una capsula per ciclo 44,45,46,47,48 (le eccezioni eseguono l'imaging in parallelo su 6 piastre con una larva ogni49 o su 4 larve in 2 piastre divise50), un inconveniente che può essere risolto con disegni paralleli come nel nostro caso. Abbiamo riassunto alcune caratteristiche del sistema utilizzato in questo studio e di altre soluzioni commerciali e su misura nella Tabella 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50, 51,52.
Un vantaggio del metodo è una lettura che cattura sia la letalità che i cambiamenti comportamentali, che possono aumentare le prestazioni delle valutazioni di tossicità. Ad esempio, mentre il test di tossicità acuta (FET) dell'embrione di pesce zebra5 ha dimostrato di predire abbastanza bene la tossicità nel test di tossicità acuta del pesce adulto53 , la sua accuratezza di previsione è stata migliorata includendo letture comportamentali54. La ragione di ciò è la debole mortalità indotta dai composti neuroattivi osservati negli embrioni di pesce, probabilmente a causa della mancanza di sindrome da insufficienza respiratoria che causa una maggiore tossicità nei pesci giovani o adulti. La neuroattività può, tuttavia, essere identificata dalla valutazione del comportamento. Inoltre, le letture comportamentali possono anche catturare gli effetti miotossici e ototossici, nonché altri effetti tossici più sottili sulla fisiologia, che sono subletali ma influenzano le prestazioni comportamentali dell'organismo.
Quando si esegue il test, è fondamentale garantire una corretta manipolazione dei composti e l'utilizzo di un lotto omogeneo di embrioni di zebrafish. Pertanto, l'utilizzo di fiale di vetro per la conservazione dei composti dovrebbe ridurre al minimo il calo delle concentrazioni di sostanze chimiche, in particolare composti idrofobici, dovuto all'assorbanza del materiale plastico. Nel caso di composti ad alto potenziale di assorbimento del polistirene "plastico", per l'incubazione possono essere utilizzate anche lastre di vetro. La pulizia degli ovuli nelle piastre di coltura tissutale utilizzate per la raccolta e la rimozione degli embrioni morti è un passaggio fondamentale per garantire lo sviluppo standard. La normale velocità di sviluppo è importante, poiché i ritardi nello sviluppo possono influenzare la maturità delle reti neurali alla base del comportamento valutato14,33. Inoltre, per consentire il confronto degli effetti composti, le uova dovrebbero essere derivate dallo stesso ceppo poiché è stato riportato che ceppi diversi presentano profili comportamentalidiversi 38,55,56,57. Durante l'esposizione, è importante incubare gli embrioni in una camera umidificata per evitare un'eccessiva evaporazione del terreno E3, che altererebbe le concentrazioni testate.
I controlli E3 devono essere incorporati in ogni ciclo al fine di determinare il livello di risposta basale del particolare lotto di embrioni utilizzato nella serie di test. In genere, eseguiamo una piastra di controlli lungo ogni serie di 5 misurazioni. Come illustrato nella Figura 2D, questo approccio consente anche di rilevare lotti con risposte non ottimali a causa di uno sviluppo ritardato o per altri motivi, come gli effetti genetici di fondo. In caso di inaspettata mancanza di risposta allo stimolo, fare attenzione anche al potenziale guasto del trasduttore. Tipicamente, le risposte di sorpresa mostrano un comportamento di concentrazione-risposta sigmoidale che consente l'adattamento della curva utilizzando un modello log-logistico. Tuttavia, in rari casi con risposte bifasiche, può essere necessario utilizzare altri modelli, come i modelli gaussiani o Cedergreen. Sono disponibili all'interno dei pacchetti R drc e bdm 27,28.
La mancanza di risposta allo stimolo vibrazionale può indicare semplicemente la morte degli embrioni o funzioni vitali gravemente compromesse a causa della citotossicità generale, ma potrebbe anche riflettere una tossicità più specifica che prende di mira i circuiti neurali di percezione dello stimolo, integrazione e produzione locomotoria. Altri possibili effetti composti sono l'interferenza con l'interfaccia neuromuscolare o con la struttura e la funzione muscolare. Per distinguere tra queste possibilità, sono necessari ulteriori saggi. Ad esempio, l'integrità strutturale dei muscoli può essere valutata con un saggio di birifrangenza58,59 e sono disponibili linee transgeniche per valutare la perturbazione della funzione muscolare e neurale60,61. Tuttavia, i dati video registrati consentono già un'analisi più dettagliata della morfologia e della risposta comportamentale degli embrioni che possono fornire le prime informazioni aggiuntive. È compromessa solo la curva a C o tutta la motilità? Sono ancora presenti residui di attività neuromuscolare, come indicato da movimenti della coda deboli o tremolanti? Tali comportamenti alterati vanno di pari passo con i cambiamenti nella morfologia, come l'edema o l'aumento della curvatura del corpo? Inoltre, è possibile valutare parametri come il tempo di latenza fino alla curva a C o la distanza percorsa durante la risposta di fuga (vedere, ad esempio, Rif. 44).
Il protocollo di screening qui descritto consente valutazioni rapide e robuste della tossicità dei composti, con il valore aggiunto di rilevare in modo specifico composti neurotossici, ototossici e miotossici non letali. Il flusso di lavoro di analisi fornito è facile da implementare e fornisce una lettura affidabile. Le modifiche dei protocolli di stimolo utilizzati nel saggio di trasloco delle vibrazioni sono state utilizzate per affrontare gli effetti composti anche su aspetti più complessi del comportamento di trasalimento, come l'inibizione del preimpulso (PPI)39,44 e l'assuefazione32,33, e potrebbero essere adattate alla configurazione dello stimolo basata su trasduttore elettrodinamico utilizzata in questo studio.
Una delle principali applicazioni dei sistemi di screening basati sulla risposta di sorpresa è la valutazione degli effetti dei composti negli screening chimici, che è rilevante sia per la valutazione della tossicità umana che per lo sviluppo di farmaci 1,4,62. Allo stesso tempo, testando le prime fasi di vita di un organismo acquatico, i risultati ottenuti hanno una rilevanza diretta per la valutazione del rischio ecotossicologico63,64. Inoltre, i sistemi di risposta all'alluvione possono essere utilizzati per la fenotipizzazione comportamentale negli screening genetici 65,66,67,68,69. Il nostro sistema, facilmente implementabile e adattabile, fornisce una configurazione conveniente ai laboratori più piccoli che intendono condurre i propri progetti di screening specifici in questi vari domini di applicazione.

Negli ultimi anni, il pesce zebra è diventato un organismo modello molto popolare per la valutazione degli effetti dei composti chimici, comprendendo aree di ricerca che vanno dallo sviluppo di farmaci allatossicologia ambientale. Come vertebrati, i pesci zebra condividono molti aspetti del loro corredo genetico e della loro fisiologia generale con gli esseri umani 2,3. Pertanto, i risultati ottenuti in questo modello sono spesso direttamente rilevanti per la salute umana. Diversi farmaci candidati attualmente in fase di sperimentazione clinica sono stati identificati in screening composti utilizzando zebrafish4.
La valutazione della tossicità è una delle principali applicazioni in cui i test che utilizzano gli stadi embrionali del pesce zebra sono di interesse. Esistono varie linee guida dell'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) per l'uso del pesce zebra nei test di tossicità ambientale 5,6. Le piccole dimensioni e il rapido sviluppo degli embrioni di zebrafish li rendono particolarmente adatti per approcci di screening su una scala di throughput medio-alta 1,3,4. Gli endpoint tossicologici presi di mira da tali screening includono malformazioni embrionali e letalità7, interferenza endocrina8, tossicità d'organo9 e valutazioni comportamentali indicative di tossicità neurale10,11. I saggi comportamentali sono possibili perché gli embrioni di zebrafish mostrano vari tipi di risposte locomotorie a stimoli diversi a seconda del loro stadio di sviluppo. Ad esempio, gli embrioni 1 giorno dopo la fecondazione (dpf) mostrano un arrotolamento spontaneo della coda12 e rispondono a una sequenza di impulsi luminosi con una sequenza tipica di movimenti, la cosiddetta risposta fotomotoria (PMR)10. Dopo la schiusa, che in genere avviene circa 48-72 ore dopo la fecondazione (hpf), gli eleuteroembrioni che nuotano liberamente13 sviluppano gradualmente risposte di sorpresa e di fuga agli stimoli vibrazionali a partire da circa 4 dpf14. Queste risposte sono caratterizzate da una curva distintiva nella direzione opposta alla direzione dello stimolo (la cosiddetta curva a C o C-start), che è seguita da una contropiega più piccola e da un comportamento di nuoto 14,15,16,17. In particolare, i comportamenti embrionali sono governati da circuiti neurali che utilizzano vari sistemi di neurotrasmettitori, consentendo di sondare gli effetti dei composti chimici che prendono di mira questi sistemi. Ad esempio, il test PMR ha rivelato gli effetti dei composti che interferiscono con la segnalazione colinergica, adrenergica e dopaminergica10, mentre la risposta di startle coinvolge i neuroni colinergici, glutammatergici e glicinergici 16,18. Inoltre, anche i composti che danneggiano i muscoli o l'interfaccia neuro-muscolare influenzeranno questi comportamenti, così come i composti tossici per le cellule ciliate dell'orecchio interno/della linea laterale19,20. L'osservazione del comportamento locomotorio del pesce zebra in risposta a uno stimolo è quindi un mezzo adatto per valutare non solo la neurotossicità, ma anche l'ototossicità e la miotossicità. Il punteggio del comportamento locomotore serve anche come proxy per la valutazione generale della tossicità/letalità, poiché gli embrioni morti non si muovono. In tal modo, i comportamenti di locomozione embrionale rappresentano una lettura integrativa per un approccio di screening della tossicità di primo livello, che indica gli effetti letali e neuromuscolari dei composti in un'unica configurazione. Dato che gli eleuteroembrioni sono già in grado di metabolizzare i composti, l'approccio può anche rilevare gli effetti dei prodotti di trasformazione metabolica 7,21,22. È importante sottolineare che gli embrioni di pesce zebra non sono considerati come stadi di vita protetti da alcune legislazioni di protezione degli animali fino alla fase di alimentazione libera dopo 120 hpf13. Pertanto, sono considerati un'alternativa ai test di tossicità sugli animali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig01.jpg"> Figura 1: Configurazione del sistema di risposta all'allattamento a vibrazione. (A) Panoramica del sistema. Le piastre con gli embrioni esposti ai composti in esame vengono posizionate sull'array di trasduttori elettrodinamici ("altoparlanti"). La telecamera viene spostata in sequenza dall'azionamento lineare azionato a cinghia nella posizione di registrazione sopra il trasduttore di destinazione. (B) Vista dettagliata del trasduttore/altoparlante con la piastra di coltura tissutale inserita sulla parte superiore. Le piastre sono illuminate dal basso da un foglio luminoso a LED a 4000-5000 lux. Una luce LED accanto all'altoparlante si accende mentre viene somministrato lo stimolo. (C) Fermo immagine del video registrato dalla telecamera dopo la stimolazione degli embrioni. (D) Screenshot del file di configurazione. (E) Screenshot dell'interfaccia del software di registrazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In questo articolo, descriviamo un protocollo di test per la valutazione degli effetti composti sulla risposta al trasalimento delle vibrazioni utilizzando un semplice dispositivo di prova costruito internamente basato su stimoli vibrazionali generati da trasduttori elettrodinamici accoppiati con una registrazione video automatizzata di diversi embrioni in movimento libero in un piatto di coltura tissutale23. Il sistema è modulare e consente la registrazione sequenziale da diverse piastre di coltura tissutale in parallelo. Nella configurazione attualmente utilizzata, cinque trasduttori elettrodinamici forniscono uno stimolo vibrazionale (500 Hz, durata 1 ms) a piastre di coltura tissutale contenenti 20 embrioni posizionati sopra di essi (Figura 1). Le piastre sono illuminate dal basso a 4000-5000 lux con fogli luminosi a LED. Una luce LED accanto a ciascun trasduttore indica i periodi di applicazione dello stimolo, mentre un oscilloscopio indica le forme d'onda e la frequenza dello stimolo applicato (per i dettagli, vedere Rif. 23). Il comportamento degli embrioni viene registrato da una telecamera ad alta velocità (Table of Materials) a 1000 fotogrammi al secondo (fps), che viene spostata sopra l'altoparlante di destinazione da un azionamento lineare azionato a cinghia. Questa velocità di registrazione è necessaria per risolvere in modo affidabile la risposta di trasalimento. Il sistema fornisce un'alternativa a basso costo e adattabile individualmente agli attuali sistemi commerciali. Il flusso di lavoro preciso descritto di seguito viene attualmente eseguito nell'ambito dell'iniziativa Precision Toxicology24 al fine di determinare le condizioni di esposizione adatte per l'acquisizione di dati OMICS da embrioni di zebrafish trattati con un set selezionato di sostanze tossiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 &#956;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z289744-1EA</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed camera</td>
			<td>XIMEA</td>
			<td>&#160;MQ013MG-ON USB 3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>215-3261</td>
			<td>Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 10 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3010.210</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 1000 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3050.100</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 20 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3020.210</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 200 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3030.100</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 25 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene)</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3902.500</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 6 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1175</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.5472.54</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system

Abbiamo sviluppato un semplice sistema di screening per la valutazione della tossicità neuromuscolare e generale negli embrioni di zebrafish. Il sistema modulare è costituito da trasduttori elettrodinamici sopra i quali possono essere posizionate piastre di coltura tissutale con embrioni. È possibile combinare più coppie di piastre di coltura altoparlante-tessuto. Gli stimoli vibrazionali generati dai trasduttori elettrodinamici inducono una caratteristica risposta di sorpresa e fuga negli embrioni. Un azionamento lineare azionato a cinghia posiziona in sequenza una telecamera sopra ciascun altoparlante per registrare il movimento degli embrioni. In questo modo, le alterazioni della risposta di sorpresa dovute alla letalità o alla tossicità neuromuscolare dei composti chimici possono essere visualizzate e quantificate. Presentiamo un esempio del flusso di lavoro per lo screening dei composti chimici utilizzando questo sistema, compresa la preparazione degli embrioni e delle soluzioni di trattamento, il funzionamento del sistema di registrazione e l'analisi dei dati per calcolare i valori di concentrazione di riferimento dei composti attivi nel saggio. L'assemblaggio modulare basato su componenti semplici disponibili in commercio rende questo sistema economico e adattabile in modo flessibile alle esigenze di particolari configurazioni di laboratorio e scopi di screening.

In recent years, zebrafish have become highly popular model organisms for the evaluation of chemical compound effects, encompassing research areas from drug development to environmental toxicology1. As vertebrates, zebrafish share many aspects of their genetic makeup and overall physiology with humans2,3. Therefore, results obtained in this model often are directly relevant to human health. Several drug candidates currently in clinical trials have been identified in compound screens using zebrafish4.
Toxicity assessment is one major application where tests using zebrafish embryonic stages are of interest. Various Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guidelines exist for the use of zebrafish in environmental toxicity testing5,6. The small size and rapid development of zebrafish embryos make them highly suitable for screening approaches on a medium to high throughput scale1,3,4. Toxicological endpoints targeted by such screens include embryonic malformations and lethality7, endocrine disruption8, organ toxicity9, and behavioral assessments indicative of neural toxicity10,11. The behavioral assays are possible because zebrafish embryos show various types of locomotor responses to different stimuli depending on their stage of development. For example, 1 day post fertilization (dpf) embryos show spontaneous tail coiling12 and respond to a sequence of light pulses with a typical sequence of movements, the so-called photomotor response (PMR)10. After hatching, typically occurring around 48-72 hours post fertilization (hpf), the freely swimming eleutheroembryos13 gradually develop startle and escape responses to vibrational stimuli starting around 4 dpf14. These responses are characterized by a distinctive bend to the direction opposite the direction of the stimulus (the so-called C-bend or C-start), which is followed by a smaller counter bend and swimming behavior14,15,16,17. Notably, embryonic behaviors are governed by neural circuits using various neurotransmitter systems, allowing for probing chemical compound effects targeting these systems. For example, the PMR assay revealed the effects of compounds interfering with cholinergic, adrenergic, and dopaminergic signaling10, while the startle response involves cholinergic, glutamatergic, and glycinergic neurons16,18. Furthermore, compounds that damage the muscles or the neuro-muscular interface will also affect these behaviors, as will compounds toxic to the inner ear/lateral line hair cells19,20. Observing zebrafish locomotor behavior in response to a stimulus is thus a suitable means to assess not only neurotoxicity but equally ototoxicity and myotoxicity. Scoring locomotor behavior also serves as a proxy for general toxicity/lethality assessment since dead embryos do not move. Thereby, embryonic locomotion behaviors represent an integrative readout for a first-tier toxicity screening approach, which indicates lethal and neuromuscular compound effects in one setup. Given that the eleutheroembryos are already capable of metabolizing compounds, the approach may also detect the effects of metabolic transformation products7,21,22. Importantly, zebrafish embryos are not considered as protected life stage under some animal protection legislations until the stage of free feeding after 120 hpf13. Therefore, they are regarded as an alternative to animal toxicity testing.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig01.jpg" /> 
Figure 1: Vibration startle response system setup. (A) Overview of the system. Plates with embryos exposed to the test compounds are placed on the electrodynamic transducer array (&#34;loudspeakers&#34;). The camera is sequentially moved by the belt-driven linear drive into the recording position above the targeted transducer. (B) Detailed view of the transducer/loudspeaker with tissue culture dish inserted on top. The plates are illuminated from below by an LED light sheet at 4000-5000 lux. An LED light next to the speaker lights up while the stimulus is given. (C) Still image of video recorded by the camera upon stimulation of the embryos. (D) Screenshot of the configuration file. (E) Screenshot of the recording software interface. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Here, we describe a testing protocol for the evaluation of compound effects on the vibration startle response using an in-house build simple testing device based on vibration stimuli generated by electrodynamic transducers coupled with an automated video recording of several freely moving embryos in a tissue culture dish23. The system is modular and allows for sequential recording from several tissue culture dishes in parallel. In the setup currently used, five electrodynamic transducers provide a vibrational stimulus (500 Hz, duration 1 ms) to tissue culture dishes containing 20 embryos placed on top of them (Figure 1). The plates are illuminated from below at 4000-5000 lux with LED light sheets. An LED light next to each transducer indicates periods of stimulus application, and an oscilloscope indicates waveforms and frequency of the applied stimulus (for details, see Ref. 23). The behavior of the embryos is recorded by a high-speed camera (Table of Materials) at 1000 frames per second (fps), which is moved above the targeted speaker by a belt-driven linear drive. This recording speed is required to reliably resolve the startle response. The system provides a low-cost, individually adaptable alternative to current commercial systems. The precise workflow detailed below is currently performed in the framework of the Precision Toxicology initiative24 in order to determine suitable exposure conditions for OMICS data acquisition from zebrafish embryos treated with a selected set of toxicants.

Autore in primo piano: Screening della tossicità ad alto rendimento mediante il saggio di risposta allo spavento dell'embrione di zebrafish

Valutazione della tossicità delle sostanze chimiche utilizzando un sistema di screening della risposta all'allievo delle vibrazioni del pesce zebra

When screening chemicals for toxicity, a current experimental challenge is the determination of toxic effects in vivo, taking into account the complexity of a whole organism, and to do this in a rapid high-throughput manner. By using a behavioral readout that monitors the escape response of zebrafish embryos to a vibration stimulus, our system allows us to identify compounds that interfere with neural or muscular function. Because dead embryos don't move, we also capture compounds that cause lethality by unspecific toxicity.The system we present can be built for a modest price and is customizable. It is also easy to maintain and all pieces can be replaced. We are currently employing the startle assay system within the PrecisionTox Consortium to determine a chemical compound dose for OMICS data acquisition.The data are generated across five model organisms and human cell lines. They will be used to derive toxicity pathways and biomarkers for human toxicity prediction.

La Figura 2A mostra la percentuale di embrioni immobili in 48 covate di embrioni wild-type non trattati (ceppo AB2O2). In media, il 14,33% degli embrioni wild-type non trattati non reagisce allo stimolo vibratorio. In 4 covate, la percentuale di larve immobili ha raggiunto il 50%, ma il 75% delle covate aveva una percentuale di larve immobili inferiore al 20%.
La Figura 2B,C mostra un esempio di calcolo tipico di una concentrazione/dose di riferimento (BMC/BMD29,30) per gli effetti composti sulla motilità con il flusso di lavoro del saggio di trasalimento a vibrazione, come attualmente eseguito all'interno del consorzio PrecisionTox24. I valori di BMC10, BMC25 e BMC50 corrispondono alle concentrazioni alle quali il 10%, il 25% e il 50% degli embrioni mostrano livelli di immotilità superiori a quelli di fondo, rispettivamente. Solo gli embrioni completamente immobili sono inclusi in questo calcolo, non quelli che mostrano ancora risposte parziali, come solo una curva a C senza successivo nuoto di fuga o solo movimenti della coda (Figura 2B). Gli embrioni sono stati esposti a 8 concentrazioni dell'inibitore del canale del sodio tricaina metansolfonato, che viene spesso utilizzato per l'anestesia dei pesci31. I dati indicano un livello di fondo di circa il 25% di immotilità in risposta allo stimolo vibratorio. A partire dall'1% di tricaina, la motilità si riduce e poi cessa sopra il 2,5%. Il flusso di lavoro KNIME calcola il BMC50 come 164,9 μM, che corrisponde all'1,07% di tricaina e a un livello di immotilità del 75% (Figura 2C). I piccoli intervalli di confidenza del 95% (indicati dalle sfumature di grigio nella curva) indicano una robusta riproducibilità dei valori di motilità in questo saggio.
La Figura 2D mostra un esempio di esecuzione di un test non ottimale, i cui dati non devono essere utilizzati per i calcoli BMC. Sono mostrati cinque gruppi di controllo trattati con E3 con diversi embrioni derivati dalla stessa covata (AB2O2 [ceppo wild-type] replica 1-5). Solo il primo gruppo mostra una risposta quasi normale, mostrando circa il 25% di motilità che è coerente con i valori di letteratura32 e quelli ottenuti nel test qui descritto, come mostrato nella Figura 2A, mentre tutti gli altri gruppi mostrano risposte comportamentali ridotte e/o incomplete (ad esempio, mostrando solo una curva a C non seguita dall'attività di nuoto, o motilità senza una chiara curva a C all'inizio). Tale risposta può verificarsi quando gli embrioni non si sviluppano correttamente e sono in uno stato immaturo a causa del ritardo dello sviluppo, che influisce sulla robustezza della risposta di trasalimento14,33.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig02v2.jpg"> Figura 2: Esempio di un risultato tipico, incluso il calcolo della dose di riferimento. (A) Percentuale di embrioni che non rispondono dopo l'impulso sonoro per larve selvatiche non trattate per 48 covate (n = 10 per covata). La media (14,33%) e la deviazione standard (±16,19%) sono indicate in rosso. (B) Valutazione del comportamento di risposta all'allusione degli embrioni (n=20 per condizione) trattati con la concentrazione indicata di tricaina in terreno E3 o con E3 da solo come controllo. Il comportamento è classificato in base alla combinazione di colori e cartoni animati indicati a destra del grafico, con ogni embrione assegnato a una sola delle seguenti classi: "immobile": l'embrione non mostra alcun movimento; "movimento della coda": l'embrione mostra il movimento della coda, ma non la curvatura a C né il comportamento di nuoto; "mobile": l'embrione mostra un movimento di nuoto, ma nessuna curvatura a C in risposta allo stimolo vibrazionale; "C-bend only": l'embrione mostra una curva a C, ma non sfugge al nuoto; "C-bend + motile": l'embrione mostra il tipico comportamento di C-bend seguito da un nuoto di fuga (la tipica risposta completa di startle). I diversi comportamenti sono mostrati come percentuale del numero totale di embrioni per ogni trattamento. (C) Grafico di calcolo BMC generato dal flusso di lavoro KNIME, che indica la percentuale di embrioni "immobili" per ogni concentrazione di trattamento. Le linee blu, rosse e nere indicano i valori di BMC10, BMC25 e BMC50, cioè le concentrazioni alle quali il 10%, il 25% e il 50% degli embrioni mostrano livelli di immotilità superiori rispetto allo sfondo, rispettivamente. (D) Esempio di un'analisi scartata. Sono mostrati cinque cicli di controllo trattati con E3 con diversi embrioni wild-type AB2O2 derivati dalla stessa frizione (replica 1-5). Solo la replica 1 mostra una risposta quasi normale, mentre gli embrioni delle corse rimanenti non mostrano la tipica risposta di C-bend + fuga dal nuoto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig02largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Parametri statistici per stimare la bontà dell'adattamento e soglie per accettare determinati valori di BMC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Proprietà di una selezione di sistemi di test di risposta vibrazionale all'allarme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%202.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
File supplementare 1: modello Excel per il file di configurazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: modello di input KNIME con un set di dati di esempio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 3: esempio di file di output KNIME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System at JoVE.com

Descriviamo il flusso di lavoro di un sistema di screening e l'analisi dei dati per valutare la tossicità dei composti chimici in base alla risposta di trasalimento dell'embrione di zebrafish. Il sistema registra i movimenti degli embrioni di zebrafish in seguito all'esposizione a uno stimolo vibrazionale e consente una valutazione integrata della tossicità/letalità generale e della tossicità neuromuscolare.

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

Quando si esaminano le sostanze chimiche per la tossicità, una sfida sperimentale attuale è la determinazione degli effetti tossici in vivo, tenendo conto della complessità di un intero organismo, e di farlo in modo rapido e ad alto rendimento. Utilizzando una lettura comportamentale che monitora la risposta di fuga degli embrioni di zebrafish a uno stimolo vibratorio, il nostro sistema ci consente di identificare i composti che interferiscono con la funzione neurale o muscolare. Poiché gli embrioni morti non si muovono, catturiamo anche i composti che causano la letalità per tossicità aspecifica.Il sistema che vi presentiamo può essere realizzato ad un prezzo modico ed è personalizzabile. È anche di facile manutenzione e tutti i pezzi possono essere sostituiti. Attualmente stiamo impiegando il sistema di analisi startle all'interno del Consorzio PrecisionTox per determinare una dose di composto chimico per l'acquisizione dei dati OMICS.I dati sono generati attraverso cinque organismi modello e linee cellulari umane. Saranno utilizzati per derivare percorsi di tossicità e biomarcatori per la previsione della tossicità umana.

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Research

JoVE Journal

Biology

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

799 Views.  Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord. Quando si esaminano le sostanze chimiche per la tossicità, una sfida sperimentale attuale è la determinazione degli effetti tossici in vivo, tenendo conto della complessità di un intero organismo, e di farlo in modo rapido e ad alto rendimento. Utilizzando una lettura comportamentale che monitora la risposta di fuga degli embrioni di zebrafish a uno stimolo vibratorio, il nostro sistema ci consente di identificare i composti che interferiscono con la funzione neurale o muscolare. Poiché g...

Video: Autore in primo piano: Screening della tossicità ad alto rendimento mediante il saggio di risposta allo spavento dell'embrione di zebrafish

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.

Ricerca

Biologia

Preparation of Zebrafish Embryos and Chemicals for Testing Neuromuscular and General Toxicity on Embryos

Preparazione di embrioni di pesce zebra e prodotti chimici per testare la tossicità neuromuscolare e generale sugli embrioni

Evaluating Lethality and Neuromuscular Toxicity of Chemicals in Zebrafish Embryos Using Vibration Startle Assay

Valutazione della letalità e della tossicità neuromuscolare delle sostanze chimiche negli embrioni di zebrafish utilizzando il saggio di vibrazione startle