Per iniziare, posizionare gli stampi per micropozzetti PDMS, la soluzione di risciacquo antiaderente e l'usura da laboratorio necessaria in una cappa per coltura tissutale. Per lavare gli stampi per micropozzetti PDMS, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aggiungere 300 microlitri di soluzione di risciacquo antiaderente a ciascun pozzetto. Quindi centrifugare la piastra, 1, 620 G per tre minuti.
Utilizzare una pompa a vuoto e una pipetta Pasteur per aspirare la soluzione. Successivamente, posizionare 500 microlitri di sospensione cellulare alla concentrazione desiderata nei micropozzetti e centrifugare la piastra a 1.620 G per tre minuti. Posizionare la piastra in un'incubatrice umidificata per consentire la formazione di sferoidi.
Per raccogliere gli sferoidi, utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, aggiungere con decisione 500 microlitri di terreno completo in ciascun pozzetto. Pipettare il terreno aggiunto su e giù in ogni quadrante tre o quattro volte per rimuovere gli speroidi. Quindi utilizzare la pipetta per aspirare delicatamente il terreno contenente gli sferoidi in una provetta per microcentrifuga.
Trasferire 50 microlitri della sospensione steroidea in una provetta per microcentrifuga. Quindi aggiungere in sequenza l'acrilato PEG a 4 bracci e il ditiolo PEG. Miscelare la soluzione risultante pipettandola su e giù per circa 10 volte.
Per ottenere 100 microlitri di una soluzione precursore di idrogel PEG al 10% in peso in volume, pipettare 20 microlitri della soluzione di precursore del gel tra due vetrini rivestiti di parafilm separati con distanziatori di silicone da un millimetro e incubare i vetrini con una soluzione di precursore di gel per consentire la gelificazione. Una volta completata la gelificazione dell'idrogel, utilizzando una spatola, staccare delicatamente i gel dai vetrini separati. Posizionare un gel per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti, assicurandosi che la superficie contenente gli sferoidi sia rivolta verso l'alto.
Aggiungere 500 microlitri di terreno completo a ciascun pozzetto per immergere completamente l'idrogel. Posizionare la piastra a più pozzetti in un incubatore umidificato per coltivare le cellule. La tecnica descritta che utilizza stampi a micropozzetti ha portato alla formazione di sferoidi con forme sferiche e polidispersità strettamente controllata.
Per sferoidi con 3.300 cellule per micropozzetto, la dimensione media dello sferoide era di circa 250 micron e la circolarità era maggiore di 0,8, considerando un valore di 1 come una sfera perfetta. I diametri degli sferoidi dipendevano dalle dimensioni del micropozzetto e dal numero di cellule per micropozzetto.
