Per iniziare, aspirare il terreno dai pozzetti in cui vengono coltivate le cellule incapsulate in idrogel nella piastra a 24 pozzetti. Sciacquare gli idrogel pipettando 500 microlitri di PBS direttamente su ciascun pozzetto contenente gli idrogel, quindi aspirare delicatamente il PBS. Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, aggiungere 500 microlitri di soluzione fissativa per pozzetto per fissare gli sferoidi nella piastra a 24 pozzetti.
Lasciare in ammollo i gel per 30 minuti a temperatura ambiente, prima di pipettare la soluzione fissativa e gettarla in un apposito contenitore per rifiuti. Successivamente, sciacquare gli idrogel con PBS tre volte come dimostrato in precedenza. Se non utilizzati immediatamente, conservare gli idrogel in 500 microlitri di PBS per pozzetto a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana.
Per colorare le cellule incapsulate in idrogel, preparare prima gli anticorpi primari opportunamente diluiti per la nestina e SOX2. Dopo aver aspirato il PBS dai pozzetti, aggiungere 50 microlitri di anticorpi diluiti a ciascun pozzetto. Incubare le cellule con gli anticorpi per 24 ore per colorarle completamente.
Quindi, utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, rimuovere la soluzione colorante e gettare i rifiuti in modo appropriato. Dopo aver risciacquato gli idrogel tre volte, conservarli in PBS a quattro gradi Celsius per un massimo di due settimane prima dell'imaging o creare immediatamente un'immagine. Per eliminare lo sferoide colorato e migliorare la trasparenza dell'imaging, aspirare prima il PBS da ciascun pozzetto.
Quindi trattare in sequenza gli sferoidi con 500 microlitri di 20%40% e 80%formamide per pozzetto per 90 minuti ciascuno. Infine, incubare gli idrogel in 100% formammide per 24 ore prima dell'imaging. Gli sferoidi sono stati sottoposti a imaging a diverse profondità dello z-stack, consentendo la valutazione della vitalità cellulare in ogni posizione all'interno dello z-stack.
Una proiezione massima che utilizza la pila di sferoidi rappresentava il punto più alto di intensità luminosa all'interno di ogni posizione, semplificato in un'unica immagine. Immagini rappresentative di sferoidi colorati hanno rivelato che il fattore di trascrizione di auto-rinnovamento, SOX2, era co-localizzato con DAPI nel nucleo. Al contrario, il marcatore delle cellule staminali nestina era presente in tutte le cellule.
Non c'era differenza tra lo sferoide fluttuante senza gel e gli sferoidi incapsulati, probabilmente a causa dell'inerzia del gel PEG utilizzato. Le immagini rappresentative delle sezioni ottiche a circa 90 micron in sferoidi chiari e non chiariti hanno rivelato che quando è stato eseguito il clearing, il nucleo sferoidale poteva essere ripreso circa 30 micron più in profondità rispetto a uno sferoide non chiarito.
