Per iniziare, prendi le ossa del femore, della tibia, del bacino e dell'omero isolate da un topo. Usa un bisturi per tagliare le placche di crescita delle ossa lunghe, rimuovendo l'epifisi. Metterlo in un piatto da 10 centimetri con M199 medio più il 2% di FBS con ghiaccio.
Quindi, utilizzare un ago calibro 28 e una siringa da 10 millilitri riempita con terreno M199 più il 2% di FBS per lavare il midollo in una provetta da 15 millilitri su ghiaccio. Metti l'osso arrossato nel piatto con l'epifisi. Lasciare il tubo da 15 millilitri in posizione verticale sul ghiaccio fino a quando il midollo non si deposita.
Quindi rimuovere il terreno M199 più il 2% di FBS Aggiungere quattro millilitri del cocktail di dissociazione B&M nella provetta da 15 millilitri e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raccogliere il surnatante e filtrare attraverso un colino cellulare da 70 micrometri in una provetta fredda da 50 millilitri. Aggiungere due millilitri di cocktail di dissociazione B&M fresco al pellet di midollo osseo rimanente e rimetterlo nel bagnomaria.
Utilizzando una pipetta da un millilitro, pipettare energicamente i pezzi di midollo osseo rimanenti. Raccogli tutte le sospensioni cellulari nello stesso tubo come prima. Aggiungere 20 millilitri di terreno M199 con 0,5% BSA e due millimolari di EDTA alla sospensione cellulare.
Successivamente, centrifugare le celle a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS con anticorpi 0,5% BSA e biotina. Incubare su un agitatore orbitale per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
Quindi, agitare accuratamente le perline magnetiche. Aggiungere 25 microlitri di perle alla provetta e incubare nuovamente sull'agitatore orbitale. Posizionare il tubo in un magnete corrispondente per due o tre minuti e raccogliere il surnatante in un tubo nuovo.
Rompi le ossa in pezzi più piccoli nel piatto da 10 centimetri usando l'estremità del tappo piatto di un tubo da 50 millilitri. Filtrare il surnatante attraverso un colino cellulare da 70 micrometri per isolare i frammenti ossei. Tagliare i frammenti ossei nel colino con le forbici.
Posizionare il filtro con i frammenti ossei su un tubo da 50 millilitri e aprire il filtro con il bisturi. Con una pinzetta, trasferire la frazione ossea in cinque millilitri di miscela di dissociazione B&M murina. Quindi posizionare il tubo orizzontalmente in un bagnomaria a 37 gradi Celsius con agitazione a 120 giri/min per 30 minuti.
Dopo la digestione, aggiungere 25 millilitri di terreno M199 con BSA allo 0,5% e EDTA da due millimolari. Filtrare il surnatante contenente cellule stromali attraverso un colino cellulare da 70 micron in una provetta fredda da 50 millilitri.
