Per iniziare, collega la stampante 3D a un computer. Caricare una siringa monouso da un millilitro con un ago nei morsetti stampati in 3D. Utilizzare due bulloni a brugola M8 per fissare i morsetti attorno alla siringa.
Ruotare la vite di comando per sollevare manualmente lo stantuffo, creando un'intercapedine d'aria di due millilitri nella siringa. Per preparare colture di vibrio cholerae, inoculare le cellule in tre millilitri di brodo Luria con 10 perle di vetro sterile. Far crescere le cellule in un'incubatrice agitata a 37 gradi Celsius per cinque o sei ore.
Allo stesso modo, inoculare E.Coli in tre millilitri di brodo liquido di Luria. Dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, inoculare 200 microlitri di coltura in brodo di Luria fresco per tre ore. Trasferire la coltura in una provetta da centrifuga da 10 millilitri.
Quindi, centrifugarlo per cinque minuti a 644 G a temperatura ambiente. A questo punto, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 microlitri di brodo liquido di Luria. Successivamente, caricare una siringa di plastica vuota da tre millilitri nella biostampante 3D.
Collegare lo stantuffo della siringa con la vite di comando. Ritrarre manualmente la siringa per trasferire il traferro e consentire un migliore movimento dello stantuffo. Applicare un ago smussato di dimensioni adeguate alla punta della siringa.
Ruotare manualmente la vite per ritrarre lo stantuffo della siringa e caricare la sospensione batterica nella siringa. Per preparare la miscela di idrogel granulare, mescolare granuli secchi di acido acrilico reticolato con 400 millilitri di brodo Lennox Luria-Bertani al 2%. Regolare il pH a 7,4 con incrementi di 500 microlitri di idrossido di sodio molare e testare il pH su una striscia reattiva.
Utilizzare una siringa di plastica sterile da 50 millilitri per trasferire la miscela di idrogel in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare la matrice a 161 G per un minuto a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare una siringa da 30 millilitri per trasferire il volume richiesto della matrice in un contenitore in cui verrà eseguita la stampa.
Quindi, posiziona i contenitori dei campioni con la matrice di idrogel sui supporti sulla piattaforma di stampa della stampante. Avvia il software di stampa 3D. Fare clic su file, quindi premere Apri file per caricare un gcode pre-programmato nel software.
Immettere la lunghezza dello spostamento. Quindi, spostare i piani X, Y, Z per centrare le testine di stampa sul piano X/Y. Premere sull'icona Home per regolare nuovamente l'asse Z.
Ruotare manualmente lentamente la vite per premere lo stantuffo della siringa fino a quando non si vede una piccola quantità di sospensione batterica sulla punta dell'ago. Rimuovere la sospensione in eccesso con una salvietta sterile monouso. A questo punto, abbassare la testina di stampa a una distanza fissa nel supporto idrogel di qualsiasi contenitore per campioni.
Fare clic su stampa per avviare la stampa. Una volta completata la stampa, chiudere i contenitori dei campioni. Smaltire la siringa e l'ago in modo appropriato.
Pulisci la stampante con etanolo al 70%. Per l'imaging di un ampio campo visivo, utilizzare una fotocamera con un obiettivo zoom montato. Visualizzare l'immagine delle celle subito dopo la stampa a temperatura ambiente.
Quindi, trasferire i campioni in un incubatore a 37 gradi Celsius. Le differenze nella dimensione dei pori della matrice non sembrano influenzare la diffusione cellulare non modale. Tuttavia, le cellule modali si diffondono più velocemente nella matrice con pori più grandi rispetto ai pori più piccoli.
La colonia di vibrio cholerae in matrici di idrogel con pori più grandi si diffonde con pennacchi diffusi e lisci. I pennacchi diffusi erano assenti nelle cellule non modali. La colonia in matrici di idrogel con pori più piccoli si diffonde solo attraverso pennacchi ruvidi, simili a frattali, sia per le cellule modali che per quelle non modali.
Entrambe le cellule sono state osservate diffondersi a velocità simili per le prime 150 ore. Tuttavia, per periodi più lunghi, alcuni campioni hanno mostrato tassi di diffusione più rapidi. Dopo l'esperimento, è stata osservata una diminuzione dello stress di snervamento, dei moduli di stoccaggio e dei moduli di perdita nell'idrogel.
